[发明专利]一种通过基因编辑技术培育抗白叶枯病水稻的方法

说明书

本发明公开一种通过基因编辑培育抗白叶枯病水稻的方法。其是利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术，将抗白叶枯病基因Xa23启动子的EBE_AvrXa23序列引入水稻xa23位点的上游启动子区，使xa23获得白叶枯病菌诱导表达的能力，从而提高水稻的白叶枯病抗性。所述xa23位点是Xa23的等位基因，其含有Xa23编码区但因其启动子区缺乏EBE_AvrXa23序列而不能转录表达。所述方法可以广泛应用于水稻抗病育种，对水稻遗传育种和生产具有重大应用前景。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及基因编辑技术提高水稻对白叶枯病抗性水稻的方法。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物，约60％的人口以稻米为主食,水稻生产的可持续发展直接关系到我国的粮食安全。水稻白叶枯病(Bacterial blight,BB)是世界水稻生产中的主要病害之一,最早于1884年在日本福冈地区发现，从50年代开始,发病范围不断扩大,目前白叶枯病的发生范围已遍及世界各水稻产区(Mew T W.Current status andfuture prospects of research on bacterial blight of rice[J].Annu RevPhytopathol,1987,25:359-382；Ou S H.Rice disease,Commonwealth AgriculturalBereaux[M],England,1985,380pp.)。水稻白叶枯病在亚洲尤其严重，在我国，从南到北，除新疆外的各稻区都有分布。

水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo)引起的一种维管束病害，感病后一般可造成水稻减产20％～30％，严重时甚至绝收。由于病原菌通过伤口或水孔侵入维管束产生危害，用药剂防治效果不佳，不仅费钱、费工且污染环境。实践证明，种植抗病品种是防治水稻白叶枯病最为经济和有效的方法。所以自20世纪60年代，发掘和利用抗白叶枯新基因一直是国内外研究的热点之一。目前已报道的水稻抗白叶枯病基因达42个，在这些抗病基因中大多数已被定位到染色体上，其中有11个已先后被克隆，包括：Xa1(Yoshimura S,Yamanouchi U,Katayose Y,etal.Expression of Xa1,a bacterial blight-resistance gene in rice,is induced bybacterial inoculation[J].Proc Natl Acad Sci.1998,95:1663-1668)、Xa3/Xa26(同一基因)(Sun X,Cao Y,Yang Z,et al.Xa26,a gene conferring resistance toXanthomonas oryzae pv oryzae in rice,encodes an LRR receptor kinase-likeprotein[J].The Plant Journal,2004,37:517-527；Xiang Y,Cao Y,Xu C,et al.Xa3,conferring resistance for rice bacterial blight and encoding a receptorkinase-like protein,is the same as Xa26[J].Theoretical and Applied Genetics,2006,113:1347–1355.)、Xa4(Hu K,Cao J,Zhang J.et al,Improvement of multipleagronomic traits by a disease resistance gene via cell wall reinforcement[J].Nat.Plants,2017,3,17009)、xa5(Iyer A S,McCouch S R.The rice bacterial blightresistance gene xa5 encodes a novel form of disease resistance[J].MolecularPlant Microbe Interactions,2004,17(12):1348-1354；Jiang G H,Xia Z H,Zhou Y L,et al.Testifying the rice bacterial blight resistance gene xa5by geneticcomplementation and further analyzing xa5(Xa5)in comparison with its homologTFIIAg1[J].Molecular Genetics and Genomics,2006,275:354–366.)、Xa10(Tian D,Wang J,Zeng X,et al.The rice TAL effector-dependent resistance proteinXA10triggers cell death and calcium depletion in the endoplasmic reticulum[J].Plant Cell,2014,26,497–515)、xa13(Chu Z,Fu B,Yang H,et al.Promotermutations of an essential gene for pollen development result in diseaseresistance in rice[J].Genes Dev,2006,20:1250–1255)、Xa21(Song W,Wang G,Chen L,et al.A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistancegene,Xa21[J].Science,1995,270:1804-1806)、Xa23(Wang C L,Zhang X P,Fan Y L,etal.XA23is an executor R protein and confers broad-spectrum disease resistancein rice[J].Mol.Plant,2015,8,290–302)、xa25(Liu Q S,Yuan M,Zhou Y,et al.Aparalog of the MtN3/saliva family recessively confers race-specificresistance to Xanthomonas oryzae in rice[J].Plant Cell and Environment,2011,34:1958-1969)、Xa27(Gu K，Yang B，Tian D,et al.R gene expression induced by atype-III effector triggers disease resistance in rice[J].Nature,2005,435,23June,1122-1125)和xa41(Hutin M,Sabot F,Ghesquiere A,et al.knowledge-basedmolecular screen uncovers a broad-spectrum OsSWEET14 resistance allele tobacterial blight from wild rice[J].Plant J.2015,84,694–703)。在上述这些抗病基因中，它们大多数抗谱狭窄、抗性持久性差或为隐性基因，在生产上不便利用。目前被有效利用的只有Xa3、Xa4、Xa7、Xa21和Xa23等少数几个。由于病原菌致病性的不断变异，已出现能克服Xa3、Xa4、Xa7和Xa21抗白叶枯病基因的菌株。目前只有Xa23表现出对所有测试菌株广谱高抗的特性，而且Xa23基因介导的抗性具有完全显性、全生育期抗病的特点，因此对水稻特别是杂交稻的遗传改良，包括分子标记辅助育种和转基因工程育种都具有十分广阔的应用前景。Xa23基因抗病的原理具有特殊性：Xa23基因正常情况下不表达，但具有一个启动子陷阱，当白叶枯病菌侵染含Xa23基因水稻时，病原菌的效应子蛋白AvrXa23(赵开军等，中国发明专利ZL 201010256332.8：激发水稻产生抗病反应的avrXa23蛋白及其编码基因，2013年5月17日)特异性激活Xa23基因的表达，而其编码蛋白Xa23就导致水稻细胞发生程序性死亡(PCD)或过敏性坏死(HR)，限制病菌在植物组织内的繁殖和扩散，从而达到抗病目的。因此，Xa23是育种家公认的目前最好用的广谱抗白叶枯病基因(Wang C L,Qin T F,YuH M,et al.The broad bacterial blight resistance of rice line CBB23istriggered by a novel transcription activator-like(TAL)effector of Xanthomonasoryzae pv.oryzae[J].Mol.Plant Pathol.2014,15,333–341；赵开军等，中国发明专利ZL201310198366.X:植物抗病蛋白Xa23及其编码基因与应用，2015年5月8日)。Xa23基因来源于个别野生稻种，在栽培稻中并不存在。但是大多数栽培稻品种中含有Xa23基因的隐性等位基因xa23(Cui H,Wang C L,Qin T F,et al.Promoter variants of Xa23allelesaffect bacterial blight resistance and evolutionary pattern[J].PLoS ONE.2017,12(10):e0185925.)。