[发明专利]一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法

说明书

本发明提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，该方法将NK细胞培养分成三个阶段，三个阶段分别为激活阶段、扩增阶段和维持培养阶段。每一段采用不同的细胞因子和抗体组合，并对相应细胞因子和抗体做了不同处理，在不同阶段对细胞密度做出了一定要求。在激活阶段采用了细胞因子包板的方式，模拟滋养层细胞与NK细胞的接触方式，加入NovoNectin增强对NK细胞的吸附；并采用MICA‑Ig重组蛋白和4‑1BBL。本发明克服了滋养层细胞的外源细胞系污染，同时提高了NK培养的效率和稳定性，培养出NK细胞纯度高，适应性高。

技术领域

本发明属于分子和细胞生物学领域，特别涉及NK细胞。

背景技术

NK(natural killer，自然杀伤)细胞是一种先天免疫系统中至关重要的毒性淋巴细胞，能对病毒感染迅速做出反应，同时对肿瘤细胞有作用。不同于其他杀伤性免疫细胞，NK细胞不需要抗体或MHC(majorhistocompatibility complex，主要组织相容性复合体)就可以快速识别并对受压细胞做出免疫反应，在这一点上是独一无二的。近年来，CAR-T(Chimeric antigen receptors-T cell，嵌合抗原受体-T细胞)成为研究的热点，可以有效的治疗血液癌，但是高风险的副作用以及实体瘤中作用有限，成为CAR-T发展的限制条件。近期的几项研究表明，CAR-NK(Chimeric antigen receptors-T cell，嵌合抗原受体-NK细胞)具有更低的毒性，在实体瘤的早期研究中展示出作用，同时由于NK细胞本身不具备特异性，所以异体NK更容易被接受且更具备产业化的基础。

NK细胞由于其广谱性和高杀伤力，具有很高的应用前景，但是原代NK细胞在PBMC(peripheral bloodmononuclear cell，外周血单核细胞)中的比例较低，约5-10％，且体外扩增培养一直是个难题。目前效率最高的方法是灭活的K562滋养层细胞，经过2-3周培养NK阳性率可达到90％以上，但是灭活的滋养层细胞难以去除，很难做到治疗级别。近两年，市面上也出现了一些重组细胞因子的培养方案，大部分能稳定的做到40-50％左右的阳性率，会有大量T细胞残余，影响后续的使用效果并可能带来GVHD的风险；做到80％以上阳性率的方案，或者扩增效率一般，或者个体差异严重，高效稳定的NK非滋养层培养方案一直是难题，使得依赖于NK的治疗方案大多都处于早期研发阶段，对临床试验造成了很大的限制。

发明内容

为了解决上述现有各种方法的不足，本发明一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法。

本发明克服了滋养层细胞的外源细胞系污染，同时提高了NK培养的效率和稳定性，培养出NK细胞纯度高(85％以上)，适应性高(在一些实施例中4个志愿者两个批次均有很好的效果)。

本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，该方法将NK细胞培养分成三个阶段，三个阶段分别为激活阶段、扩增阶段和维持培养阶段。

每一段采用不同的细胞因子和抗体组合，并对相应细胞因子和抗体做了不同处理，在不同阶段对细胞密度做出了一定要求。

本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，在激活阶段采用了细胞因子包板的方式，模拟滋养层细胞与NK细胞的接触方式，加入NovoNectin增强对NK细胞的吸附；并采用MICA-Ig重组蛋白和4-1BBL。

MICA-Ig是NK细胞重要的激活因子，可以与NK细胞表面的NKG2D结合，激活NK细胞，同时该蛋白融合了IgG1FC，可以与NK表面的Fc受体结合，起到双重激活的作用；4-1BBL是很多免疫细胞的激活剂，可以起到辅助NK细胞活化的作用。

本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，在扩增阶段采用了多种因子的组合，其中使用IL15RAIL15-Ig融合蛋白。