[发明专利]一种外源基因定点整合T7噬菌体基因组的方法及应用

权利要求书

1.一种T7噬菌体，其特征在于，所述T7噬菌体为gene 10，gene 11缺陷型T7噬菌体，且其基因组中含有正向的处于gene 9基因下游的整合酶宿主整合attB位点。

2.一种含pIVOP-EXS质粒的宿主菌，其特征在于，所述pIVOP-EXS质粒基因组中含有权利要求1所述T7噬菌体编码gp10A蛋白的完整基因座，以及整合酶蛋白编码区；所述gp10A蛋白即权利要求1所述T7噬菌体gene 10所编码蛋白。

3.一种微环DNA，其特征在于，所述微环DNA含有待导入外源基因片段，整合酶噬菌体整合attP位点，以及权利要求1所述T7噬菌体gp11蛋白的编码区；所述gp11蛋白即权利要求1所述T7噬菌体gene 11所编码蛋白。

4.一种向T7噬菌体导入外源基因的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的T7噬菌体，权利要求2所述的含pIVOP-EXS质粒的宿主菌，权利要求3所述的微环DNA。

5.根据权利要求4所述的向T7噬菌体导入外源基因的产品，其特征在于，

所述T7噬菌体的基因组中，保留gene 10基因上游T7启动子和下游转录终止信号编码区；

所述pIVOP-EXS质粒的基因组中，所述gp10A蛋白的完整基因座包括上游T7启动子，核糖体结合区和蛋白编码区；所述T7噬菌体编码gp10A蛋白的完整基因座和整合酶蛋白编码区之间插入有T7早期转录终止子；

所述微环DNA的基因组中，还包括T7启动子、转录终止子，各编码区从上游至下游依次为：整合酶噬菌体整合attP位点、T7启动子、转录终止子、T7噬菌体gp11蛋白的编码区、外源基因片段。

6.根据权利要求5所述的向T7噬菌体导入外源基因的产品，其特征在于，所述pIVOP-EXS质粒的基因组中，所述gp10A蛋白的完整基因座和整合酶蛋白编码区基因以多顺反子形式共同受T7启动子的驱动表达。

7.根据权利要求4所述的向T7噬菌体导入外源基因的产品，其特征在于，所述微环DNA的基因组中，含有p15A中度拷贝数复制子；所述含pIVOP-EXS质粒的宿主菌为含有pIVOP-EXS质粒的MC1061F^-宿主菌。

8.一种外源基因定点整合T7噬菌体基因组的方法，其特征在于，采用权利要求7所述的产品，包括以下步骤：

1)微环DNA的制备：以pMCB为模板，通过PCR扩增获得微环DNA前体，并使其环化，得到微环DNA；

2)MC1061F^-的转化：

取含有pIVOP-EXS质粒的MC1061F^-宿主菌株，以热激法或电转化法将上述微环DNA转化至所述含有pIVOP-EXS质粒的MC1061F^-宿主菌株；

3)MCB体内整合：

于复苏后的上述宿主菌株中加入所述T7噬菌体进行体内整合，菌体裂解，得到裂解液；

4)MCB整合子的分离：将上述裂解液铺板在琼脂糖LB培养基进行培养，至出现噬菌斑，取噬菌斑单克隆，进行PCR检测整合子，收取目的整合子。

9.根据权利要求8所述的外源基因定点整合T7噬菌体基因组的方法，其特征在于，步骤2)MC1061F^-的转化中，所述MC1061F^-宿主菌株的基因型为araD139Δ(araA-leu)7697Δ(lac)X74 galK16 galE15(GalS)lambda-e14-mcrA0 relA1 rpsL150(Str^R)spoT1 mcrB1hsdR2。

10.根据权利要求8所述的外源基因定点整合T7噬菌体基因组的方法，其特征在于，步骤2)MC1061F^-的转化中，所述热激法具体操作步骤如下：

将所述微环DNA与MC1061F^-宿主菌株混合后冰浴30min，42℃水浴30sec，冰浴2min冷却，最后加入900μl 37℃，无抗性LB培养基，于37℃，220rpm摇床培养1h复苏菌体。