[发明专利]展示有机磷酸酸酐酶的枯草芽胞及其制备方法

说明书

本发明涉及展示有机磷酸酸酐酶的枯草芽胞及其制备方法，属于生物技术领域，用于有机磷农药环境污染的生物修复。本发明的枯草芽胞宿主经改造后具有编码有机磷酸酸酐酶OPAA、衣壳蛋白CotG及自身启动子的核苷酸序列。通过营养衰竭法进行生胞培养后，衣壳蛋白CotG与有机磷酸酸酐酶OPAA的融合蛋白在宿主中被表达并展示在枯草芽胞表面。所述的枯草芽胞具有水解有机磷污染物的能力，对复杂环境也具有良好的抗逆性，可作为绿色环保的农药净化剂用于受污染环境的生物修复。

技术领域

本发明涉及展示有机磷酸酸酐酶OPAA的枯草芽胞及其制备方法，属于生物技术领域，用于有机磷农药环境污染的生物修复。

背景技术

有机磷化合物的防护和污染治理事关国家和公共安全。传统的治理方式包括物理和化学降解，虽然能够取得良好的效果，但也带来了一些问题，如不能直接用于人体或精密仪器，化学洗消剂常具有毒性或腐蚀性，对环境造成二次污染等。有机磷酸酸酐酶来自嗜盐细菌Alteromonas sp.JD6.5，是一种脯氨肽酶，可高效水解多种G类神经毒剂，和C端携带脯氨酸的二肽(Xaa-Pro)，是目前降解G类神经性毒物效果最好的酶。与传统的物理和化学方式相比，其具有催化速率快、条件温和、无毒、无腐蚀性的优点，已应用于有机磷化合物的污染治理、化学毒剂的防护与洗消、有机磷化合物的检测等领域。

有机磷酸酸酐酶的应用能够减少化学物质的使用、减轻后勤负担和环境污染，但在实际生产和应用中还存在一些技术难题。例如：酶的分离纯化较繁琐，而且对酶的活性也会产生影响；有机磷酸酸酐酶对温度和pH变化比较敏感，贮存稳定性不高，不利于在自然环境甚至恶劣条件下使用。并且，纯酶在使用时需要与盐溶液、泡沫基质等联用。因此，存在开发更稳定的有机磷酸酸酐酶的需求，以使有机磷酸酸酐酶的使用更便捷、应用范围更广。

枯草芽胞展示技术是指利于基因工程手段或吸附作用将外源蛋白展示在芽胞表面，并保持其相对独立的空间构象和原有的生物活性。借助芽胞优良的抗逆性提升外源蛋白的贮存稳定性，适合在复杂条件中应用；芽胞展示技术避免了酶的分离纯化，降低了生产成本。因此枯草芽胞展示技术在近年来发展迅速，已在疫苗制备、生物催化等领域展现出良好的应用前景。然而，在现有技术中并不存在普遍适用的表面展示系统，因为外源蛋白是否能够有效展示受到各种因素影响，其中靶蛋白的大小和特性是决定枯草芽胞杆菌的芽胞展现有效性的主要因素(请参见Wang He等，Appl Microbiol Biotechnol(2017)，101：933-949)。但尚无芽胞展示有机磷酸酸酐酶的报道。

发明内容

本发明的目的是解决有机磷酸酸酐酶在实际环境中应用时稳定性差、分离纯化程序繁琐的技术难题，提供展示有机磷酸酸酐酶的枯草芽胞及其制备方法。

本发明所述枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，已于2018年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15428，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明采用的技术方案：一种展示有机磷酸酸酐酶的枯草芽胞，该枯草芽胞表面展示有机磷酸酸酐酶OPAA与衣壳蛋白CotG的融合蛋白，具有OPAA降解有机磷化合物的生物活性，对复杂环境具有优良的抗逆性；其中，有机磷酸酸酐酶OPAA的氨基酸序列为：