[发明专利]展示有机磷酸酸酐酶的枯草芽胞及其制备方法

权利要求书

1.一种展示有机磷酸酸酐酶的枯草芽胞，其特征在于该枯草芽胞表面展示有机磷酸酸酐酶OPAA与衣壳蛋白CotG的融合蛋白，具有OPAA降解有机磷化合物的生物活性，对复杂环境具有优良的抗逆性；其中，有机磷酸酸酐酶OPAA的氨基酸序列为：MNKLAVLYAEHIATLQKRTREIIERENLDGVVFHSGQAKRQFLDDMYYPFKVNPQFKAWLPVIDNPHCWIVANGTDKPKLIFYRPVDFWHKVPDEPNEYWADYFDIELLVKPDQVEKLLPYDKARFAYIGEYLEVAQALGFELMNPEPVMNFYHYHRAYKTQYELACMREANKIAVQGHKAARDAFFQGKSEFEIQQAYLLATQHSENDNAYGNIVALNENCAILHYTHFDRVAPATHRSFLIDAGANFNGYAADITRTYDFTGEGEFAELVATMKQHQIALCNQLAPGKLYGELHLDCHQRVAQTLSDFNIVDLSADEIVAKGITSTFFPHGLGHHIGLQVHDVGGFMADEQGAHQEPPEGHPFLRCTRKIEANQVFTIEPGLYFIDSLLGDLAATDNNQHINWDKVAELKPFGGIRIEDNIIVHEDSLENMTRELRARLTTHSLRGLSAPQFSINDPAVMSEYSYPSEPLSYEEEIKKSTFIVHVRTRRILVRRRTLSPILIAVTPMPAITAGLM，衣壳蛋白CotG的氨基酸序列为：MGHYSHSDIEEAVKSAKKEGLKDYLYQEPHGKKRSHKKSHRTHKKSRSHKKSYCSHKKSRSHKKSFCSHKKSRSHKKSYCSHKKSRSHKKSYRSHKKSRSYKKSYRSYKKSRSYKKSCRSYKKSRSYKKSYCSHKKKSRSYKKSCRTHKKSYRSHKKYYKKPHHHCDDYKRHDDYDSKKEYWKDGNCWVVKKKYK。

2.一种展示有机磷酸酸酐酶的枯草芽胞制备方法，其特征在于该枯草芽胞制备方法步骤如下：

(1)提取枯草芽胞杆菌基因组作为模板，通过PCR扩增衣壳蛋白CotG及其自身启动子的核苷酸序列；使用限制性内切酶分别对上述扩增的核苷酸序列以及大肠-枯草的穿梭质粒载体进行双酶切；将两种酶切产物以1∶3～1∶5的比例混合，使用核酸连接酶连接，构建包含衣壳蛋白CotG及其自身启动子核苷酸序列的重组质粒；将上述重组质粒通过化学转化法导入大肠杆菌克隆菌株宿主，通过抗生素筛选培养后挑选单克隆；对上述单克隆进行培养扩增，并提取重组质粒进行酶切电泳验证和基因测序鉴定；

(2)通过人工合成的方式合成有机磷酸酸酐酶OPAA的核苷酸序列：atgaataaattagcggtgtt atacgctgaa catattgcaa ccttgcaaaa gcgcacgcgc gaaattatcg agcgcgaaaacctagacggt gttgttttcc attctggcca ggcgaagcgc cagttcttag acgatatgta ctacccgtttaaggtgaatc cacaatttaa ggcctggttg ccagtgatag ataatccaca ctgttggatt gtcgcgaatggcactgataa gccaaagttg attttctatc gccctgtgga cttttggcac aaggtccccg atgagccgaatgagtattgg gctgactact ttgatattga actgctagtg aaaccggatc aggtagaaaa gttactaccctatgataagg cgcgatttgc atatattggc gaatacttgg aagtcgctca agctttgggt tttgagctgatgaatccgga gccggtaatg aacttttatc attaccaccg tgcctacaaa acgcagtacg aacttgcttgtatgcgtgag gcgaataaaa tcgctgtaca aggtcacaaa gctgcgcgag atgcgttttt tcaaggcaagtccgaatttg aaattcaaca agcctacctg ttagcgaccc aacacagcga aaatgacaac gcttacggcaacattgtggc gctaaatgaa aactgcgcca ttttgcacta cacgcacttt gatcgtgttg ctcctgctacccatcgttct tttttgattg acgctggcgc caacttcaat ggttacgcag ccgatattac tcgaacctatgactttactg gtgaagggga atttgctgag cttgttgcca ccatgaagca gcaccaaatt gcactatgtaaccagttggc gcctggcaag ttatatggtg agttacacct tgattgtcac caacgtgtgg cgcaaacactgagtgacttt aacatcgtcg acttatcggc cgatgagatt gttgccaaag gcattacctc cacgttcttcccacatggtt taggccatca tattggttta caagtacatg atgtgggtgg ttttatggct gacgagcagggcgcacacca agagccgcct gaaggtcacc cattcctgcg ttgcacgcgt aagattgaag cgaatcaagtatttaccatt gaacctgggt tgtactttat tgattccttg ctcggtgatt tagcagcgac agataataatcagcatatta attgggacaa ggtcgcagag cttaagcctt tcggtggtat tcgtattgag gacaatatcattgttcacga agacagcctt gagaatatga ctcgcgagct aagagctcga ttaaccaccc attcactgcggggcctaagt gctccgcagt tttctatcaa tgatcctgcc gttatgtctg aatactcata ccctagtgagcccttaagtt acgaagaaga aatcaaaaag agcactttta ttgtgcatgt gcgcacacgc cggatattagtgcggcgaag gactttatcg ccgatattaa tcgccgttac cccgatgccc gccataactg ctgggctcatgtag，并通过PCR扩增；使用限制性内切酶分别对上述扩增的核苷酸序列和步骤(1)中构建的重组质粒进行双酶切；将两种酶切产物以1∶3～1∶5的比例混合，使用核酸连接酶将有机磷酸酸酐酶基因连接于衣壳蛋白CotG基因的C端，构建包含衣壳蛋白CotG、CotG自身启动子以及有机磷酸酸酐酶OPAA核苷酸序列的重组质粒；将上述重组质粒通过化学转化法导入大肠杆菌克隆菌株宿主，通过抗生素筛选培养后挑选单克隆；对上述单克隆进行培养扩增，并提取重组质粒进行酶切电泳验证和基因测序鉴定；

(3)将步骤(2)中构建的重组质粒通过电转化法导入枯草芽胞杆菌表达宿主，通过抗生素筛选培养后挑选单克隆；对上述单克隆进行培养扩增，并提取重组质粒进行酶切电泳验证；

(4)将步骤(3)中构建的枯草芽胞杆菌表达宿主通过营养衰竭法进行生胞培养，在DSM培养基中培养1～2天后收集培养液；DSM培养基即8g营养肉汤培养基，1g氯化钾，0.25g七水合硫酸镁，2mg四水合氯化锰，氢氧化钠调pH至7.0，蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min，加入过滤膜除菌的1ml 1M硝酸钙溶液和1ml 1mM硫酸铁；

(5)使用灭菌水对上述培养液稀释10⁶后，取100～200微升涂布于筛选平板，过夜培养后统计总菌数，另取上述培养液于80℃孵育15min以上，稀释106后取100～200微升涂布于筛选平板，过夜培养后统计芽胞数，结果表明工程菌株的芽胞生成率达60～70％；

(6)对步骤(4)培养液中的芽胞进行纯化，4000～20000g离心集菌，弃上清后以2mg/ml溶菌酶溶液重悬，37℃孵育30min～1h，4000～20000g离心收集芽胞，分别使用1M NaCl和1MKCl洗涤，之后使用纯水洗涤3～5次，4000～20000g离心收集芽胞，重悬于10ml PBS缓冲液；

(7)将步骤(6)中纯化后的芽胞重悬于十分之一体积的剥离缓冲液，0.1M DTT，0.5％SDS，0.1M NaCl；70℃以上高温孵育30min以上，获取的芽胞衣壳蛋白通过透析除盐后使用组氨酸亲和柱纯化，纯化蛋白通过蛋白免疫印迹和点印迹实验进行分析，与对照组相比重组芽胞的提取蛋白均有显著化学发光，结果表明每个芽胞表达的融合蛋白分子达10⁵数量级；

(8)使用鼠源组氨酸抗体孵育步骤(6)中纯化后的芽胞，PBS洗涤后以羊抗鼠-FITC二抗孵育，经PBS洗涤后，滴加至载玻片，置于激光共聚焦显微镜下观察分析，与对照组相比重组芽胞具有显著荧光，表明融合蛋白被成功展示在枯草芽胞的表面；

(9)以氟磷酸二异丙酯为反应底物，在50mM碳酸铵，0.1mM氯化锰，pH＝8.0的反应环境中加入20％步骤(6)制备的芽胞悬液，25℃反应8min后使用氟离子仪检测反应溶液中的氟离子浓度，结果表明：展示有机磷酸酸酐酶的枯草芽胞具有显著水解活性，达10.67U/mg；

枯草芽胞分别采用有机试剂、冻融、酸性、碱性、蛋白酶处理芽胞后检测活性，结果表明：展示有机磷酸酸酐酶的枯草芽胞水解活力在有机试剂乙醚、-15～-20℃冻融、pH3～5、pH9～11、蛋白酶K环境中的耐受性显著增强，P小于0.001。