[发明专利]一种检测miRNA-218-5p表达水平的试剂在制备鸭肠粘膜氧化应激损伤检测试剂中的应用

说明书

本发明涉及一种检测miRNA‑218‑5p表达水平的试剂在制备鸭肠粘膜氧化应激损伤检测试剂中的应用，包括miRNA，所述miRNA为应激过程中下调的miRNA‑218‑5p，所述miRNA的靶基因为AKR7A2，所述miRNA在氧化应激过程中低表达，通过上调的AKR7A2基因的表达，参与小肠上皮细胞的氧化应激应答。本发明提出的miRNA‑218‑5p与鸭小肠粘膜氧化应激损伤有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，miRNA‑218‑5p的表达量在应激组和对照组样本间的差异极显著，可以实现早期辅助选择。

技术领域

本发明涉及分子标记领域，尤其涉及一种检测miRNA-218-5p表达水平的试剂在制备鸭肠粘膜氧化应激损伤检测试剂中的应用。

背景技术

鸭是一种胆小、易惊的家禽。随着鸭规模化、设施化养殖的发展，蛋鸭笼养成为一种重要的生产方式，逐渐在蛋鸭生产中推广应用，在标准化笼养流程中，免疫、运输、上笼、环境温度变化等各种有害刺激，可使鸭生产性能降低，极大的影响养殖效率。有害刺激易诱发氧化应激反应。在应激发生时，血液流向肌肉、脑等组织，小肠组织发生缺血，又最迟得到恢复，肠道持续缺氧造成氧化应激，不仅会影响肠道屏障和吸收功能，还可导致消化道黏膜的损伤，引发肠细菌异位，诱发多种疾病。

microRNA(miRNA)是一类长度约20-24nt的非编码单链小分子RNA，可以通过与靶基因mRNA的3’UTR互补结合对靶基因进行转录后调控，在细胞增殖、分化和凋亡、细胞氧化应激应答、肿瘤形成等生理过程中发挥重要的调控作用。

miRNA参与动物应激应答是通过结合靶基因mRNA的3’UTR进行负调控实现的。如果仅通过生物信息学分析预测，将得到大量互作基因，对其筛选和验证难度巨大，而通过同一组织，特定生理时期RNA-seq和miRNA-seq测序，并进行关联分析，会更加准确获得相应生理过程的功能miRNA及其靶向基因，为鉴定调控组织氧化应激这类复杂生理机制提供一个全新手段。因此，本发明提出一种检测miRNA-218-5p方法及其在鸭肠粘膜氧化应激损伤的应用，以解决现有技术中的不足之处。

发明内容

针对上述问题，本发明提出的miRNA-218-5p与鸭小肠粘膜氧化应激损伤有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，miRNA-218-5p在应激组和对照组样本间的差异极显著，同时本发明提出的miRNA可用于抗逆蛋(肉)鸭的辅助遗传育种中，可以实现早期辅助选择，并且本发明提出的检测miRNA-218-5p表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提取到荧光定量实验所需的整套试剂，即方便使用，又保证了结果的一致性。

本发明提出一种检测miRNA-218-5p表达水平的试剂在制备鸭肠粘膜氧化应激损伤检测试剂中的应用，包括miRNA，所述miRNA为应激过程中下调的miRNA-218-5p，所述miRNA的靶基因是醛酮还原酶7(AKR7A2)，所述miRNA通过上调的醛酮还原酶7(AKR7A2)基因的表达，参与小肠上皮的氧化应激应答。

进一步改进在于：所述miRNA在氧化应激鸭小肠上皮细胞模型中增殖和分化中的应用中是通过上调的醛酮还原酶7(AKR7A2)基因的表达，在小肠上皮细胞的氧化应激损伤过程中发挥抗氧化作用。

进一步改进在于：所述miRNA表达水平及其下调的醛酮还原酶7(AKR7A2)基因的表达是利用RT-qPCR检测，根据鸭小肠组织中的所述miRNA的表达水平，判断鸭小肠抗氧化能力并进行筛选。

进一步改进在于：检测鸭小肠组织中的所述miRNA表达水平，包括如下步骤：

(1)提取待测鸭小肠组织中含有miRNA的总RNA；

(2)设计目标miRNA和内参miRNAU6的茎环引物，利用反转录酶进行miRNA反转录；

(3)采用miRNA特异的正向引物，以及通用下游引物，利用荧光定量PCR试剂盒进行miRNA-218-5p和内参miRNA的扩增；