[发明专利]一种山羊环状RNA circ_ZCCHC2及其鉴定方法及应用

权利要求书

1.一种山羊环状RNA circ_ZCCHC24的鉴定方法，其特征在于：所述山羊环状RNAcirc_ZCCHC24的核苷酸序列如后附序列表SEQ ID NO:1所示，其鉴定方法包括以下步骤：

步骤一：采集山羊的肾、心、肌肉、肝、脾、卵泡和肺组织样本放入液氮带回实验室，采用组织RNA提取试剂盒提取样品总RNA，并检测其浓度与质量，作为待检测样品；

步骤二：将上述步骤一中的RNA通过反转录试剂盒进行逆转录获得cDNA；

步骤三：利用上游引物PF1和下游引物PR1对步骤二中获得的待检测样品通过实时荧光定量qRT-PCR技术进行序列扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的序列长度，再经由Sanger测序技术，获得接头序列的真实碱基信息，与山羊环状RNA circ_ZCCHC24的接头序列进行比对，如果序列信息一致，则能够证明山羊环状RNA circ_ZCCHC24是真正成环的RNA；

步骤四：利用上游引物PF1和下游引物PR1和步骤二中获得的cDNA，通过实时荧光定量qRT-PCR技术，对不同组织样本中的山羊环状RNA circ_ZCCHC24进行相对定量分析，取得的数据采用2^-ΔΔCT法计算并获得不同组织样本中山羊环状RNA circ_ZCCHC24的相对表达量，根据不同组织样本中山羊环状RNA circ_ZCCHC24的相对表达量判断待测样本是否存在该环状RNA及其表达水平；

所述上游引物PF1的序列：TGTGCTTCAACAAAGGGCACTA，见序列表SEQ ID NO:2；

所述下游引物PR1的序列：TTCTCTCTCGTGTAGGCTTGGA，见序列表SEQ ID NO:3；

所述山羊环状RNA circ_ZCCHC24的接头序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的一种山羊环状RNA circ_ZCCHC24的鉴定方法，其特征在于：所述步骤一中的待检测样品RNA提取过程为：采用RNA提取试剂盒提取样品总RNA，并检测其浓度与质量，所述步骤二中逆转录获得cDNA的具体实施方法为：采集山羊不同组织样本，提取RNA后利用反转录试剂盒合成cDNA，所述步骤三中的实时荧光定量qRT-PCR反应体系如下：SYBR Green Supermix 10uL,上游引物0.25uL，下游引物0.25uL，待检测cDNA模板0.5uL，ddH₂O 9uL，总体系为20uL，所述步骤四中的实时荧光定量qRT-PCR反应条件为：94℃，3min；94℃，10s，60℃，10s，72℃，30s，40个循环；95℃，10s，62℃，60s，97℃，1s，1个循环。

3.一种山羊环状RNAcirc_ZCCHC24超表达载体在培育高繁殖力山羊品种中的应用，其特征在于：所述山羊环状RNA circ_ZCCHC24的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：山羊环状RNAcirc_ZCCHC24超表达载体为pCD2.1-circ_ZCCHC24，包括环状RNA超表达载体pCD2.1-ciR和山羊环状RNAcirc_ZCCHC24的全长序列。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述pCD2.1-circ_ZCCHC24超表达载体的构建过程为：将环状RNA circ_ZCCHC24的全长序列片段，整合到环状RNA超表达载体pCD2.1-ciR中，得到所述山羊环状pCD2.1-circ_ZCCHC24超表达载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述pCD2.1-circ_ZCCHC24超表达载体的构建过程中还包括进行circ_ZCCHC24的全长序列片段的PCR扩增的上游引物PF2和下游引物PR2，上游引物PF2核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物PR2核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。