[发明专利]黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量的同步检测RT-PCR试剂盒及其检测方法

说明书

本发明属于生物领域，具体涉及一种黄曲霉毒素产量与Nor‑1基因转录量的同步检测RT‑PCR试剂盒及其检测方法。本发明建立了同步检测黄曲霉菌株产毒量和nor‑1基因转录量的同步RT‑PCR检测方法，利用所述方法检测所得黄曲霉菌株产毒量、nor‑1基因转录量与采用HPLC定量黄曲霉毒素、Nanodrop定量Nor‑1基因转录量的结果存在良好的线性关系，因此，基于同步检测RT‑PCR方法获得的AFT/Nor‑1的比值结果可靠、准确，可以作为判定黄曲霉菌株产毒力高低的鉴定指标，实现了对黄曲霉菌株产毒力的快速、准确的鉴定评价，对黄曲霉毒素污染预警与防控具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量的同步检测RT-PCR试剂盒及其检测方法。

背景技术

黄曲霉毒素是迄今发现毒性最强的一类真菌毒素，以黄曲霉毒素B1为例，其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，被国际癌症组织列为I类致癌物。黄曲霉毒素极易污染花生、玉米、稻米等粮油作物产品，还污染核桃、开心果以及中药材等众多植物产品。国内外发生过多起黄曲霉毒素引发的人畜群体中毒事件。据国际癌症研究署(IARC)最新报道，全球仅发展中国家就有约5亿人口饱受黄曲霉毒素暴露风险。我国是黄曲霉毒素污染较重地区。农业部多年普查结果表明，我国主要农作物产品受黄曲霉毒素污染呈持续加重趋势，严重地区毒素含量超过限量标准的数百倍；虽然强产毒菌株占比不到20％，但却已成为威胁农作物产品质量安全的重大隐患。

黄曲霉毒素主要由黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生。已有研究表明，不同黄曲霉菌株产生黄曲霉毒素的能力——即产毒力可相差数百倍，强产毒菌株是造成高污染的重要源头，但至今缺乏特异性快速鉴别强产毒菌株的有效方法。目前鉴别黄曲霉菌株产毒力的方法主要有两类：一类是培养菌株一定时间后直接通过测定其产生黄曲霉毒素的量来评价其产毒能力。这类方法一是时间长，必须首先分离出菌株，再培养，最后通过检测黄曲霉毒素含量进行评价；二是黄曲霉毒素的生物合成受影响因素非常多且复杂，同一菌株培养不同培养批次之间的黄曲霉毒素产量差异大，结果难以用作表征菌株本应恒定的自身产毒特性，从而影响该方法鉴别评价结果的准确可靠性。另一类方法是通过测定产毒相关基因转录水平来评价菌株产毒力，有文献报道检测Nor-1基因评价产毒力。但是，这类方法的不足之处在于：自然状态下就有至少约20％的菌株因检测基因以外的产毒相关基因的缺失导致天然不产毒，但检测基因仍可表达，从而导致这类方法的假性结果。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量的同步检测RT-PCR试剂盒及其检测方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量同步检测RT-PCR试剂盒，包括：

1)用于扩增表面展示黄曲霉毒素抗独特型纳米抗体的噬菌体所释放DNA片段的引物和探针：上游引物Ph-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物Ph-R，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；荧光探针Ph-probe，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

2)用于扩增Tq-nor-1基因的引物和探针：上游引物Tq-nor1-F，核苷酸序列如SEQID NO.4所示；下游引物Tq-nor1-R，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；荧光探针Tq-probe，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

3)通用型探针qPCR预混液、DNA聚合酶、MgCl₂、dNTPs、H₂O。

按上述方案，所述上下游引物：Ph-F、Ph-R、Tq-nor1-F、Tq-nor1-R在PT-PCR扩增反应体系中的终浓度均为300～400nM。

按上述方案，所述荧光探针：Ph-probe和Tq-probe在PT-PCR扩增反应体系中的终浓度均为200～400nM。