[发明专利]黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量的同步检测RT-PCR试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量同步检测RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括：

1)用于扩增表面展示黄曲霉毒素抗独特型纳米抗体的噬菌体所释放DNA片段的引物和探针：上游引物Ph-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物Ph-R，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；荧光探针Ph-probe，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；和，

2)用于扩增Tq-nor-1基因的引物和探针：上游引物Tq-nor1-F，核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；下游引物Tq-nor1-R，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；荧光探针Tq-probe，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；和，

3)通用型探针qPCR预混液、DNA聚合酶、MgCl₂、dNTPs、H₂O。

2.根据权利要求1所述黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量同步检测RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述上下游引物：Ph-F、Ph-R、Tq-nor1-F、Tq-nor1-R在RT-PCR扩增反应体系中的终浓度均为300～400nM。

3.根据权利要求1所述黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量同步检测RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光探针：Ph-probe和Tq-probe在RT-PCR扩增反应体系中的终浓度均为200～400nM。

4.根据权利要求1所述黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量同步检测RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶在RT-PCR扩增反应体系中最终用量为0.5U～1.0U，所述MgCl₂在RT-PCR扩增反应体系中的终浓度为1mM～2mM，所述dNTPs在RT-PCR扩增反应体系中的终浓度为200uM～400uM。

5.利用权利要求1～4任一所述试剂盒同步RT-PCR检测黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)黄曲霉毒素定量S型标准曲线的建立：免疫竞争反应阶段，在黄曲霉毒素单克隆抗体包被量一定的情况下，采用不同浓度的黄曲霉毒素标品与表面展示黄曲霉毒素抗独特型纳米抗体的噬菌体竞争结合黄曲霉毒素单克隆抗体，免疫竞争反应结束后，将结合在黄曲霉毒素单克隆抗体上的表面展示黄曲霉毒素抗独特型纳米抗体的噬菌体洗脱，不同浓度的黄曲霉毒素标品对应洗脱不同量的表面展示黄曲霉毒素抗独特型纳米抗体的噬菌体，洗脱液中的噬菌体在PCR加热的过程中会释放DNA分子，释放的DNA分子作为RT-PCR反应中的扩增靶标，采用所述试剂盒将各洗脱液分别进行同步RT-PCR扩增反应，扩增反应结束后获得不同的Ct值，以黄曲霉毒素浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标，进行回归分析，得到黄曲霉毒素的定量S型标准曲线；

(2)Nor-1基因转录量RT-PCR标准曲线的建立：将nor-1基因DNA片段Tq-nor1已知拷贝数的样本连续稀释成不同拷贝数，然后采用所述试剂盒对各拷贝数Tq-nor1分别进行同步RT-PCR扩增反应，扩增反应结束后获得不同的Ct值，以Tq-nor1拷贝数的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标，进行回归分析，得到nor-1基因转录量的定量标准曲线；

(3)培养黄曲霉菌株，取黄曲霉菌孢子进行振荡培养，培养结束后，过滤取菌株培养液和黄曲霉菌丝球；将菌株培养液稀释一定倍数后，替代步骤(1)所述免疫反应中的黄曲霉毒素标品参与免疫竞争反应，免疫竞争反应后将结合在黄曲霉毒素单克隆抗体上的表面展示黄曲霉毒素抗独特型纳米抗体的噬菌体洗脱，将洗脱液中噬菌体释放的DNA分子作为同步RT-PCR扩增反应中定量扩增黄曲霉毒素的模板；另将黄曲霉菌丝球干燥后，提取总RNA并反转录成cDNA，将该cDNA稀释一定倍数后作为同步RT-PCR扩增反应中定量扩增Nor-1基因的模板；

(4)以所述噬菌体释放的DNA分子和所述cDNA为模板进行同步RT-PCR扩增反应，扩增反应结束后获得两个Ct值，将两个Ct值分别代入黄曲霉毒素的定量S型标准曲线和nor-1基因转录量的定量标准曲线，换算得到黄曲霉毒素浓度和nor-1基因转录量，以此确定黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量的比值。