[发明专利]一种热稳定性提高的苯丙氨酸氨基变位酶突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的苯丙氨酸氨基变位酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明的苯丙氨酸氨基变位酶的突变体序列如SEQ ID NO.2所示，该突变酶的比酶活相对于野生型略有提高，在50℃处理1h仍有83％残留酶活性，温度稳定性相比野生酶有了大幅度的提高，更适合应用于工业生产。

技术领域

本发明涉及一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

苯丙氨酸氨基变位酶(PAM)可用于催化苯丙氨酸发生异构化，催化α-苯丙氨酸转氨基变为药用价值更高的β-苯丙氨酸，β-苯丙氨酸是合成抗癌药物紫杉醇的重要前体，具有广阔的市场前景。但是，该反应是一个放热反应，生产过程中高温会影响酶的结构，导致酶活下降，进而产生了大量的能耗，提高了生产成本。此外，该酶在催化过程中酶活相对较低，不利于β苯丙氨酸的生成。在生产催化过程中，提高该的热稳定性以及酶活尤为重要。

目前，苯丙氨酸氨基变位酶主要来源于成团泛菌(Pantoea agglomerans)、海洋链霉菌(Streptomyces maritimus)和中华红豆杉(Taxus chinensis)。中华红豆杉来源的目的基因在原核生物中表达不够理想，海洋链霉菌来源的基因在温度较高时表现出苯丙氨酸裂解酶活性，而野生型成团泛菌来源的苯丙氨酸氨基变位酶活力和热稳定性也有限。因此，获得一种酶活提高、稳定性增强的苯丙氨酸氨基变位酶对于β-苯丙氨酸的工业化生产具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体，含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的细胞。

本发明的第五个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ IDNO,2所示的苯丙氨酸氨基变位酶突变体I91M。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET28a。

本发明的第六个目的是提供一种提高苯丙氨酸氨基变位酶稳定性的方法，所述方法是将SEQ ID NO.3所示的苯丙氨酸氨基变位酶第91位异亮氨酸突变为甲硫氨酸。

本发明的第七个目的是提供一种生产所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的方法，将表达所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的基因工程菌接种于LB培养基中，35-37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于20-22℃诱导16-18h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种于含卡那霉素的LB表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，20℃诱导16-18h，表达苯丙氨酸氨基变位酶突变体酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括收集所述基因工程菌的菌体，将菌体破碎后收集上清，将上清膜过滤后，用His Trap HP柱分离得到苯丙氨酸氨基变位酶突变体。

本发明还提供所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体及所述基因工程菌在制备含有β-苯丙氨酸的产品中的应用。