[发明专利]一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法

说明书

本发明涉及一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法，本发明首次通过采用向枯草芽孢杆菌中插入启动子P₄₃、信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，同时敲除裂解基因Xpf、SkfA、LytC和SdpC后，构建获得重组工程菌pHT01‑P₄₃‑PhoD‑MTSase‑MTHase(LM1234)，并采用了特殊序列的刚性连接，从而实现了目标酶的功能表达；通过实际发酵生产海藻糖后，惊奇的发现，由于改造后的重组菌胞外酶活能够占到总酶活的70％，实现了胞外产酶与转化的同步进行，从而省去了传统发酵液中需要先进行酶分离然后再进行海藻糖生产的过程，实现了重组菌的发酵与海藻糖的生产同于耦合化。

技术领域

本发明涉及一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是由两个吡喃环葡萄糖以1,1-糖苷键连接而成，是一种稳定的非还原性二糖。

海藻糖广泛存在于自然界中，具有保湿性，抗冻抗干燥性，热酸稳定性等特殊的生物学功能，对生物大分子有着非特异性的保护作用，因此在医学、农业、化妆品、食品等行业应用潜力巨大。自20世纪80年代后，各国相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。

酶转化法生产海藻糖是上世纪90年代逐渐兴起的方法，主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法这三种方法。当前以麦芽糊精为底物经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因工程菌、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌的共同作用生成海藻糖，即双酶法生产海藻糖，受到广泛关注。以该方法生产海藻糖的转化率高达80％以上，在一定程度上降低了海藻糖的生产成本并极大的推动了海藻糖的工业化生产进程。

中国专利文献CN103215300A(申请号201310174692.7)公开了一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产海藻糖合成酶并将此酶用于生产海藻糖的方法。具体是将海藻糖合成酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产海藻糖合成酶。经过简单分离，发酵液中的海藻糖合成酶能够直接用于海藻糖的制造。虽然该技术中的海藻糖合酶可以分泌到胞外，但仍然无法实现耦合发酵生产海藻糖。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法。

本发明技术方案如下：

一种高产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC，所述基因Xpf的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因SkfA的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，所述基因LytC的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述基因SdpC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，将上述基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC分别连接到敲除载体后，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC，然后将敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC分别转化B.subtilisWB800n感受态细胞，制得重组菌B.subtilis(LM1234)；