[发明专利]一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法

权利要求书

1.一种高产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC，所述基因Xpf的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因SkfA的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，所述基因LytC的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述基因SdpC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，将上述基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC分别连接到敲除载体后，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC，然后将敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC分别转化B.subtilisWB800n感受态细胞，经筛选，制得重组菌B.subtilis LM1234；

所述敲除载体为载体pMAD；

(2)分别PCR扩增组成型启动子P₄₃、分泌信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，然后通过重叠PCR连接启动子P₄₃、分泌信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase之间通过特殊序列的刚性连接肽连接，构建重组质粒pHT01-P₄₃-PhoD-MTSase-MTHase；然后转化步骤(1)制得的重组菌B.subtilisLM1234，即得；

所述特殊序列的刚性连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，连接为将基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC与敲除载体pMAD分别用限制性内切酶BamHI/EcoRI酶切后，酶切产物经T4连接酶连接，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，转化条件为：电压2000V的条件下转化5ms。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，启动子P₄₃的PCR扩增引物核苷酸序列如下：

P43-F：CGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGC；下划线为SacI酶切位点

P43-R：CTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATA。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，分泌信号肽PhoD的PCR扩增引物核苷酸序列如下：

PhoD-F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGG，

PhoD-R：CTGGGTCATTACTTCAAAGGCCCCAACCG。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase的PCR扩增引物核苷酸序列如下：

MTSase-F：GGGGCCTTTGAAGTAATGCGTACACCGGTTTCA，

MTSase-R：CGCGGATCCTTAGCTTTCGCCTCCTGT下划线为BamHI酶切位点。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase的PCR扩增引物核苷酸序列如下：

MTHase-F：GGGGCCTTTGAAGTAATGACGCATACATACCCGA

MTHase-R：CGCGGATCCTTAATCGCTCACAACTGCCG下划线为BamHI酶切位点。