[发明专利]大豆种子蛋白表达谱的构建方法及大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用

说明书

本发明提供了大豆蛋白表达谱的构建方法及大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用，属于蛋白表达谱构建技术领域。本发明采用SDS‑PAGE等技术得到大豆蛋白电泳胶片，通过对大豆蛋白电泳胶片分级，对分级蛋白分别进行胰蛋白酶酶解和液相色谱法质谱联用(LC‑MS)鉴定大豆蛋白的种类和含量。大豆蛋白根据电泳进行分级鉴定，有助于检测低含量的蛋白，避免低丰度的蛋白被高丰度蛋白覆盖，从而得到更多蛋白。通过对大豆蛋白的分级鉴定，从生物信息学的角度出发找到大豆蛋白的功能特征，并进行蛋白的分类与数据库构建，为从事大豆蛋白相关研究提供技术和数据支撑。

技术领域

本发明属于蛋白表达谱构建技术领域，具体涉及一种大豆种子蛋白表达谱的构建方法及大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用。

背景技术

种子是种子植物的繁殖体系，对延续物种起着重要作用，在植物的生命周期中占据核心地位。大豆干种子是人类主要的食用部分，还是重要的工业原料。大豆种子蛋白含量约占种子干重的40％左右，且富含人体所需的八种必需氨基酸。大豆种子蛋白主要储存在子叶部分，对于种子萌发、胚胎发育、抗性和抗营养性有着极其重要的影响。

随着蛋白按组学技术的发展，利用SDS-PAGE电泳技术为精确鉴定出大豆种子照分子量的大小分离，获得清晰的电泳图谱，同时为后续蛋白的分级、蛋白质的鉴定提供良好的基础。

目前，蛋白质谱已经广泛应用于各类有机物的结构分析，例如1994年，Kamo等用双向电泳技术对拟南芥的叶、茎、根、种子和愈伤组织的蛋白质组进行分析，并建立了相应的数据库；Satoni等对拟南芥种子萌发过程的蛋白质组进行分析，建立的数据库为研究种子萌发过程相应的基因表达提供了新证据。模式植物拟南芥种子鉴定出种子蛋白质1300多种。Won Kyong Cho等通过对水稻细胞壁进行蛋白质谱分析，找到了与水稻细胞壁相关的496个蛋白。

蛋白质的合成是一个复杂的过程，其中蛋白质丰度是衡量基因表达的一个最终指标，在生物体生命活动中具有重要作用的蛋白质通常都为高丰度蛋白质。在大豆种子蛋白质组学领域，Mooney等已研究得到大豆成熟干种子的双向电泳图谱，但是仅鉴定了部分蛋白，尚未有大豆干种子全蛋白的鉴定研究。而大豆种子蛋白质的研究对于种子的休眠、种子萌发、胚胎发育等具有重要意义，弄清干种子中的蛋白种类以及蛋白含量对大豆种子的营养特性、加工品质等具有指导意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大豆种子蛋白表达谱的构建方法及大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用，所述方法能够鉴定到包括多种低丰度蛋白在内的大豆种子蛋白。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种大豆种子蛋白表达谱的构建方法，包括以下步骤：

1)将大豆材料、抽提缓冲液和巯基乙醇混合，振荡，离心，收集的上清液为大豆总蛋白；

2)将所述步骤1)中的大豆总蛋白进行在SDS-PAGE凝胶中进行不连续垂直电泳2～3h，得到大豆蛋白电泳凝胶；所述SDS-PAGE凝胶中浓缩胶的质量浓度为3.5％～5％，所述SDS-PAGE凝胶中分离胶的质量浓度为12％；

3)将所述步骤2)中的大豆蛋白电泳凝胶依次进行染色和脱色液脱色，得到大豆蛋白电泳胶片；

4)将所述大豆蛋白电泳胶片进行划分成19级，得到19级胶条；所述划分的标准是按照大分子量到小分子量的顺序对大豆蛋白电泳胶片依次切胶条，将明显的蛋白条带单独切作一级，将弥散的蛋白条带切为一级；

5)将得到的19级胶条采用脱色剂分别进行脱色处理，将脱色19级胶条分别进行胰蛋白酶溶液水解，得到19级肽段；

6)将所述步骤5)中19级肽段中的每一级肽段进行质谱分析，将得到的质谱数据原始文件采用Maxquant在Photozome大豆蛋白数据库中进行搜库，得到大豆种子蛋白表达谱。