[发明专利]大豆种子蛋白表达谱的构建方法及大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用

权利要求书

1.一种大豆蛋白表达谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将大豆材料、抽提缓冲液和巯基乙醇混合，振荡，离心，收集的上清液为大豆总蛋白；

2)将所述步骤1)中的大豆总蛋白在SDS-PAGE凝胶中进行不连续垂直电泳2～3h，得到大豆蛋白电泳凝胶；所述SDS-PAGE凝胶中浓缩胶的质量浓度为3.5％～5％，SDS-PAGE凝胶中分离胶的质量浓度为12％；

3)将所述步骤2)中的大豆蛋白电泳凝胶依次进行染色和脱色液脱色，得到大豆蛋白电泳胶片；

4)将所述大豆蛋白电泳胶片进行划分成19级，得到19级胶条；所述划分的标准是按照大分子量到小分子量的顺序对大豆蛋白电泳胶片依次切胶条，将明显的蛋白条带单独切作一级，将弥散的蛋白条带切为一级；

5)将得到的19级胶条采用脱色剂分别进行脱色处理，将脱色19级胶条分别进行胰蛋白酶溶液水解，得到19级肽段；

6)将所述步骤5)中19级肽段中的每一级肽段进行质谱分析，将得到的质谱数据原始文件采用Maxquant法在Photozome大豆蛋白数据库中进行搜库，得到大豆种子蛋白表达谱。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中大豆材料的质量和抽提缓冲液、巯基乙醇的体积比为4～6mg：500μl：8～12μl。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述抽提缓冲液为以下两种中的任意一种：一是包含0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷，质量浓度2％十二烷基硫酸钠，5mol/L尿素和质量浓度为0.1％溴酚蓝的水溶液，pH值为8.0；二是包含0.4mol/L蔗糖，0.01mol/LNaCl，0.002mol/L MgCl₂·6H₂O，0.05mol/LHepes的水溶液，pH值为7.8。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中不连续垂直电泳的电压为100V；所述SDS-PAGE凝胶的厚度为1～1.5mm。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中染色用染色液每升包括以下组分：2.25g考马斯亮蓝，440ml乙醇和60ml冰醋酸；

所述脱色液每升包括以下组分：200ml甲醇和50ml冰醋酸。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中水解前还包括以下步骤：将所述脱色19级胶条分别依次经10mmol/L的二硫苏糖醇溶液、乙腈、60mmol/L碘乙酰胺溶液、100mmol/LNH₄HCO₃溶液和ACN处理，处理后的胶条再冻干。

7.根据权利要求1或6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中所述胰蛋白酶溶液的浓度为2.5～10ng/μl；

所述水解的温度为37℃；所述水解的时间为20h；

所述水解后还包括将得到的水解产物经C18Cartridge脱盐；

所述步骤5)中脱色剂包含90～120mmol/L NH₄HCO₃和体积浓度为28～32％的ACN溶液。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤6)中搜库的参数设定如下：enzyme为Trypsin；missed cleavage sites设为2；固定修饰为Carbamidomethyl；动态修饰设定Oxidation和Acetyl；

所述Maxquant法搜库时，鉴定标准是蛋白的匹配肽段率≥20％。

9.权利要求1～8任意一项所述的构建方法得到的大豆蛋白表达谱在分析生物代谢途径中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，所述生物代谢途径包括核糖体相关途径、碳代谢途径、氧化磷酸化途径、光合作用途径、叶绿素代谢途径以及大豆特有的代谢途径；

所述大豆特有的代谢途径包括绿色种皮大豆中的次级产物的生物合成途径、蛋白输出途径、黄色种皮大豆中的谷胱甘肽代谢以及精氨酸的生物合成途径。