[发明专利]胍基化壳聚糖的制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种胍基化壳聚糖的制备方法，通过将壳聚糖(CS)、精氨酸(L‑Arginine)、及4‑(4,6‑二甲氧基三嗪)‑4‑甲基吗啉盐酸盐(DMT‑MM)同时加入甲醇‑水混合溶剂中，室温下搅拌6～8h，真空状态下除去溶剂，产物溶解在超纯水中，透析，冻干，得到胍基化壳聚糖，简化步骤，提高产率，进一步减少副反应发生；本发明还提供一种采用胍基化壳聚糖制备抗菌性纳米微球的方法，该方法以硫酸葡聚糖(DS)为交联剂，制得包裹有溶菌酶的胍基化壳聚糖纳米微球，可缓慢释放抗菌组分，利用胍基化壳聚糖对细胞膜的穿透作用破坏革兰氏阴性菌(G‑)外膜脂质结构的稳定性，使内壁层的肽聚糖暴露出来，进而被溶菌酶水解，通过二者协同作用，增强对G‑的抑制效果，该胍基化壳聚糖抗菌纳米微球亦具备一定的长效抑菌作用。

技术领域

本发明涉及功能高分子材料领域，具体涉及一种胍基化壳聚糖的制备方法及采用胍基化壳聚糖制备抗菌性纳米微球的方法及应用。

背景技术

溶菌酶是专一作用于细菌细胞壁的天然抗菌蛋白，可通过切断细胞壁肽聚糖网络上的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键联结，解体肽聚糖支架从而分解细菌。近年来，溶菌酶已广泛用于畜禽饲料的添加剂中，也被开发为注射剂、凝胶剂、喷雾剂等多种剂型用于人或动物的抗菌、抗病毒等治疗。研究表明，溶菌酶对革兰氏阳性菌(G+)和酵母型真菌、丝状真菌的抑菌效果较好，还具有抗炎、免疫调节等作用。但是，由于革兰氏阴性菌(G-)的细胞壁表面覆盖着一层由磷脂、脂多糖、脂蛋白组成的脂质外膜，肽聚糖网络被包裹在内层且比G+的少，因此溶菌酶对G-的抑制效果较弱。同时，溶菌酶分子上的六个色氨酸残基是参与溶菌酶和底物结合的活性位点，在体循环过程中易氧化失活。Alahdad等将葡聚糖结合到溶菌酶上，在G-细胞膜50℃加热20min的条件下有明显G-抑制效果；Martinez等将脂肪酸与溶菌酶联用，可在生理温度下有效抑制G-，但对溶菌酶结构上的色氨酸没有保护作用；Ibrahim等将三氯生与溶菌酶复合，保护色氨酸残基的同时提高G-的抑菌效率，但近年亦有三氯生可能致癌的报导。研究者还以透明质酸-酪氨共聚物(Kurisawa等)、聚乳酸-聚乳酸共聚物(Singh等)、玉米蛋白(Zhong等)等高分子材料为载体包裹溶菌酶，可以保护溶菌酶的活性并控制释放，但对改善其G-抑制作用的效果不明显。

壳聚糖是自然界中广泛存在的甲壳素的脱乙酰产物，分子表面的伯胺基(-NH₂)质子化后带正电，对细菌细胞膜脂质层的静电亲和能力赋予了其抑菌特性，也是普遍用于食品、医疗、农业等领域的天然抑菌剂。研究表明，高分子量的壳聚糖对G+的抑制作用明显高于G-，但随着分子量的减小，壳聚糖逐渐显示出对G-的抑制优势，G+的抑制效果减弱。Vallapa等认为不同分子量壳聚糖的抑菌谱变化与其对细胞膜的作用机理有关，高分子量的壳聚糖吸附在细菌细胞表面，形成一层高分子膜，阻止了营养物质向细胞内运输，从而起到抑菌作用；而低分子量的壳聚糖则可透过细胞膜进人细菌细胞内，与细胞内带负电的物质结合，使细胞的正常生理功能受到影响，导致细菌死亡。以中低分子量壳聚糖为包裹溶菌酶的载体，壳聚糖通过与细胞膜的静电吸附作用破坏G-外膜脂质结构的稳定性或直接穿透外膜，内壁层的肽聚糖暴露出来被溶菌酶水解，则可二者协同作用，增强对G-的抑制效果。但是，壳聚糖仅酸性条件下的水溶性及较高粘度限制了其在生理中性pH条件下的抗菌性应用，需通过结构修饰进一步改善其性能。