[发明专利]胍基化壳聚糖的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种胍基化壳聚糖的制备方法，其特征在于，将壳聚糖(CS)、精氨酸(L-Arginine)、及4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)同时加入甲醇-水混合溶剂中，室温下搅拌6～8h，真空状态下除去溶剂，产物溶解在超纯水中，透析，冻干，得到胍基化壳聚糖，合成路线为：

2.根据权利要求1所述的胍基化壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖的分子量为5～60kDa，脱乙酰度>75％。

3.根据权利要求1所述的胍基化壳聚糖的制备方法，其特征在于，精氨酸、4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)、及壳聚糖的摩尔比例：1:1～3：0.003～0.05；甲醇-水混合溶剂中甲醇与水的比例为1:0.2～5。

4.根据权利要求1所述的胍基化壳聚糖的制备方法，其特征在于，相同条件下，随着壳聚糖分子量的降低，精氨酸的接枝率升高，即壳聚糖的胍基化程度提高。

5.一种采用权利要求1～4任一项制得的胍基化壳聚糖抗菌纳米微球,其特征在于,配置含溶菌酶的胍基化壳聚糖(GCS)溶液及硫酸葡聚糖(DS)溶液，分别对上述两溶液加入适量NaCl调节其离子强度为0.1mol/L并先用微孔滤膜过滤；以DS为底液，采用注射泵以一定的速度向其中加入所述含溶菌酶的胍基化壳聚糖(GCS)溶液；持续搅拌10min,静置6h后，将混合液倒入离心管中，以5000rpm的速度离心20min，倒掉清液，再进行去离子水分散、离心两次，最后将下层微球冷冻干燥两天，制得抗菌纳米微球，4℃干燥避光保存待用。

6.根据权利要求5制得的胍基化壳聚糖抗菌纳米微球,其特征在于,所述硫酸葡聚糖、所述胍基化壳聚糖、及所述溶菌酶的质量比为：1:0.2～1:0.05～0.5；注射泵以10～20mL/h的速度向底液DS溶液中加入0.2～2mL所述含溶菌酶的胍基化壳聚糖(GCS)溶液。

7.根据权利要求7制得的胍基化壳聚糖抗菌纳米微球,其特征在于,所述溶菌酶的浓度为0.5～5mg/mL，所述胍基化壳聚糖的浓度为1～5mg/mL，所述硫酸葡聚糖的浓度为1～5mg/mL，所述胍基化壳聚糖抗菌纳米微球的载药率15～50％及包封率20～60％。

8.根据权利要求6或7制得的胍基化壳聚糖抗菌纳米微球,其特征在于,所述抗菌性纳米微球的粒径小于250nm。

9.根据权利要求8制得的胍基化壳聚糖抗菌纳米微球,其特征在于,所述抗菌性纳米微球在生理pH下的体外释放至少7天。

10.一种采用权利要求9制得的胍基化壳聚糖抗菌纳米微球的应用，其特征在于，

步骤一，将一定浓度所述抗菌纳米微球加入到培养至对数期的革兰氏阴性菌(G-)菌液中，37℃振荡培养；

步骤二，取步骤一中的部分所述菌液培养一段时间后测定其电导率值，以电导率值变化反映抗菌纳米微球对细菌细胞外膜的影响情况；如果菌液中电导率显著升高，表明由于胍基化壳聚糖的细胞外膜穿透作用，导致细胞外膜通透性增大，引起了电解质的外渗；如果电导率无明显增加，表明胍基化壳聚糖无法穿透细胞外膜；

步骤三，另取一部分步骤一中的所述菌液，在3500rpm条件下离心10min，取菌液上清液测定其碱性磷酸酶(AKP)含量，以AKP含量的变化反映抗菌纳米微球对细菌细胞壁的影响情况；如果AKP含量明显上升，表明抗菌纳米微球中释放的溶菌酶在胍基化壳聚糖的帮助下可以穿透细胞外膜，破坏细胞壁的完整性；如果AKP含量无明显变化，则抗菌纳米微球中释放的溶菌酶无法穿透细胞外膜，也无法作用于细胞壁；

步骤四，通过步骤二及步骤三所得出的抗菌纳米微球对细菌细胞外膜及细胞壁的影响情况，分析改性壳聚糖与溶菌酶的协同抑菌机理；如果步骤二中电导率显著升高且步骤三中AKP含量有明显变化，则表明胍基化壳聚糖与溶菌酶协同抑制了革兰氏阴性菌(G-)的生长；如果步骤二中电导率无显著升高或步骤三中AKP含量无明显变化则表明胍基化壳聚糖与溶菌酶无法抑制革兰氏阴性菌(G-)的生长。