[发明专利]一种椰子成熟合子胚组织培养方法

说明书

本发明公开了一种椰子成熟合子胚组织培养方法，以椰子成熟合子胚为外植体，在组培各阶段严格控制培养基配方，经组织培养，愈伤诱导率可达到98.0％，体胚诱导率最高可达到98.4％，体胚再生率最高可达到98.7％，移栽成活率最高可达到98.1％。本发明培养基配方和方法更为广谱，适用于海南本地高种、文椰2号、文椰3号等多个品种，且重复性好、周期短，有利于工厂化、商业化推广应用。

技术领域

本发明涉及一种椰子成熟合子胚组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

组织培养技术是利用植物的根、茎、叶、花、果等外植体快速繁殖无性系的方法，已经在多种植物上获得成功。组织培养技术是椰子的快速繁殖最有效的无性繁殖方法。在椰子组织培养方面，研究人员先后用合子胚、未成熟花序、幼嫩子房、茎尖、幼叶等进行体外培养，都在不同程度上获得成功。早在1978年，Fisher和Tsai尝试用椰子胚进行组织再生，但仅获得了愈伤组织，没有成功再生植株。1994年，Verdeil等人第一次成功从椰子未成熟花序中获得再生植株。Chan等(1998年)通过体胚方式从椰子的胚芽中获得再生植株。Fernando等(2000年)利用椰子7-9个月未成熟的合子胚诱导获得球状愈伤，并进一步诱导体胚发生，最终获得再生植株。Prasanthi等(2007年)以椰子的未受精子房为外植体，获得了再生植株。Perera等(2009年)利用椰子花药中的小孢子为外植体，获得再生植株。G.Sandoval-Cancino等(2016年)利用椰子成熟合子胚作为外植体，成功获得再生植株。

椰子的组织培养技术已经获得了一定的研究成果，但采用成熟合子胚进行组织培养的相关研究较少，且仍然存在一些显而易见的问题，阻碍了椰子快繁技术的发展。

1、无通用于不同椰子基因型的培养方法

椰子是高度杂合的植物，而至今为止所发布的培养基和培养方法中，没有哪一种是广适的，都是仅仅受限于某一类基因型，甚至同一个品种中，有的植株可以成功诱导愈伤，而有的不能。斯里兰卡的椰子研究所设有专门的组培中心，他们在长达几十年的时间里，一直面临该问题，难以攻克。

2、试验的重复性差

同样的培养基，同样的外植体(来自同一植株)，难以重复获得相同或相似结果。菲律宾椰子署首次获得的再生植株早已经挂果，但后续的试验再没有获得成功。

3、组培周期长

由于椰子本身的生长特性，以及现有的组培技术，椰子组培苗的生产周期一般较长。以花序外植体为例，愈伤诱导阶段约为3个月，愈伤扩繁阶段约为3个月，体胚形成阶段1个月，体胚萌发生根6个月，植株成苗6个月，整个试验流程共计17个月。若要建立成熟的可大规模使用的技术体系，所需时间更长。

此外，繁殖系数低，增殖难等问题也亟待解决。

综上所述，目前尚无可用于生产的成熟技术方案。

发明内容

鉴于此，本发明提出一种更为广谱的、重复性好的培养基配方和方法，提高椰子外植体愈伤诱导率、体胚诱导率、体胚再生率和移栽成活率，同时进一步缩短组培周期。

本发明采取的技术方案如下：

一种椰子成熟合子胚组织培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选择：成熟合子胚；

(2)依次采用愈伤诱导培养基、愈伤扩繁培养基、体胚诱导培养基、体胚成熟培养基、体胚萌发培养基、再生植株壮根培养基和组培苗移栽培养基进行培养；

其中，

愈伤诱导培养基包括以下成分：在Y3培养基中添加100～150μM 2,4-D、5～10μM6-BA、2～8g/L植物凝胶、1～8g/L活性炭和20～50g/L蔗糖；