[发明专利]一种悬浮培养白及细胞的方法

说明书

本方案公开了中药材药物研究技术领域的一种悬浮培养白及细胞的方法，该方法中将白及种子诱导并继代后得到的愈伤组织作为外植体，接种到悬浮培养基中进行悬浮培养，悬浮培养基为MS+6‑苄氨基嘌呤1.5±0.45mg/L+2,4‑二氯苯氧乙酸2.5±0.5mg/L+30±20g/L蔗糖；悬浮培养基pH为5.9±0.1；外植体接种量与培养基的体积比例为1/80～1/20g/mL；接种后在转速为110±10r/min、温度为25±2℃的黑暗条件下进行40～50天振荡悬浮培养。本方案采用细胞组织悬浮培养的方法，将白及种子诱导并继代后的愈伤组织作为外植体进行悬浮培养，该方法不仅可以为细胞水平规模化培养白及，进一步为白及工业化生产和化学成分高效生物合成提供实验依据和理论基础。

技术领域

本发明涉及中药材药物研究技术领域，具体涉及一种悬浮培养白及细胞的方法。

背景技术

白及（Bletilla striata (Thunb.) Rchb. f.）兰科白及属多年生草本植物，是我国传统的名贵中草药，并被广泛应用于工业、和花卉绿化等产业，作为天然的粘胶和美容佳品，具有很好的开发和应用前景，且用途仍然在不断拓展。其假鳞茎具有止血收敛、消肿生肌之功效，主治内外出血、肿瘤、溃疡等症，外用可治烧烫伤、手足皲裂、促进伤口愈合。现代药理研究也发现，白及具有代血浆、骨髓造血、延缓衰老、增加机体免疫力等保健作用。

随着市场需求的急剧增加和白及野生生境的严重破坏，传统的白及生产模式已远远不能满足其用途的不断拓展和市场需求的急速增长。而植物细胞悬浮培养技术通过完全人为可控地满足细胞生长分化最佳条件，高效促进细胞增殖，目前利用植物细胞培养生产次生代谢物最有前景的生物合成方式，在药用植物的药用成分合成中具有重要的意义。国内外已建立了包括红豆杉、人参、长春花等多种药用植物的细胞悬浮培养技术，但是关于白及细胞悬浮培养的研究却鲜有报道，且其在组织培养过程中易褐化死亡也增加了悬浮培养生产白及的难度。

发明内容

本发明意在提供一种悬浮培养白及细胞的方法，以解决现有白及主要以固体培养，增殖速率较低，容易褐化，培养周期长，且不能实现规模化生产等的技术问题，（用增殖率来评价，即增殖率=（目标量-初始量）/初始量x100%）。

本方案中的一种悬浮培养白及细胞的方法，包括以下步骤：

步骤一、取成熟的白及蒴果进行无菌消毒，并获取白及种子；

步骤二、诱导白及种子萌发获取愈伤组织：将白及种子放于无菌的诱导培养基中在黑暗条件下培养，培养温度为25±2 ℃，培养时间为60～90天；诱导培养基为：MS+6-苄氨基嘌呤1.5±0.5mg/L+2,4-二氯苯氧乙酸2.5±0.5mg/L+30±20g/L蔗糖+7±1g/L琼脂，诱导培养基的pH为5.9±0.1；

步骤三、接种：将步骤二培养获取的愈伤组织接种到继代培养基中在黑暗条件下培养，继代培养基为：MS+6-苄氨基嘌呤1.5±0.5mg/L+2,4-二氯苯氧乙酸2.5±0.5mg/L+30±20g/L蔗糖+7±1g/L琼脂，继代培养基的pH为5.9±0.1；接种培养的温度为25±2 ℃，时间为25～45天后得到外植体；

步骤四、悬浮培养：将步骤三得到的外植体接种到悬浮培养基中进行悬浮培养，悬浮培养基为MS+6-苄氨基嘌呤1.5±0.45mg/L+2,4-二氯苯氧乙酸2.5±0.5mg/L+30±20g/L蔗糖；悬浮培养基的pH为5.9±0.1；外植体的接种量与培养基的体积比例为1/80～1/20g/mL；接种后在转速为110±10r/min、温度为25±2 ℃的黑暗条件下进行振荡悬浮培养，悬浮培养时间为40～50天。

本方案的有益技术效果是：本方案采用细胞组织悬浮培养的方法，白及种子进行诱导培养得到白及的愈伤组织，再将愈伤组织进行接种继代培养，得到外植体，最后利用白及的外植体进行悬浮培养，可以克服目前白及组织培养主要以固体培养，增殖速率较低，容易褐化，培养周期长，且不能实现规模化生产等的技术问题。