[发明专利]同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和RNA的试剂及方法

权利要求书

1.同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和RNA的方法，其特征在于：包括使用试剂A、试剂B和试剂C：

试剂A的组分为：pH7.4的20mM~100mM Tris-HCl、10mM~100mM NaCl、1mM~10mM MgCl₂、体积浓度0.1%~1% NP40、pH8.0的1mM~10mM EDTA和体积浓度1%~10% Glycerol；

试剂B的组分为pH7.4的10mM~100mM Tris-HCl、1mM~5mM Na₃VO₄、10mM~100mM NaCl、0.1%~1% TritonX-100、1mM~10mM EDTA、体积浓度1%~10% Glycerol、1mM~10mM EGTA、质量浓度0.1%~10% SDS、1mM~10mM NaF、质量浓度0.1%~0.5% Deoxycholate和1mM~10mMNa₄P₂O₇；

试剂C的组分为：质量浓度为0.1~1%异硫氰酸胍盐和0.1~0.5% β-巯基乙醇的水饱和苯酚溶液；

所述方法是：

（1）在提取细胞蛋白质和RNA前，在试剂A和C中均添加终体积浓度1%的磷酸酶抑制剂、终体积浓度1%的蛋白酶抑制剂和终浓度1U/μl的RNase分解酶抑制剂；

（2）准备新鲜细胞样品，离心收集1×10⁶~5×10⁶个细胞，添加1~2ml PBS缓冲液清洗两遍；

（3）添加0.1~1ml提取试剂A，-4℃~4℃裂解细胞60min，释放出细胞质蛋白和RNA；

（4）离心3000rpm×10min×4℃，上清液中含有细胞质蛋白及RNA，沉淀中含有细胞核蛋白及RNA，将上清液转移到新离心管中，同时保留沉淀；

（5）添加1~2ml PBS缓冲液清洗步骤（4）得到的沉淀两遍；离心3000rpm×10min×4℃，收集沉淀；

（6）向步骤（5）收集的沉淀中添加试剂B，试剂B的添加体积为试剂A添加体积的0.01~1倍，放置在-4℃~4℃裂解30min，每间隔10min涡旋震荡一次；

（7）离心14000rpm×15min×4℃，上清液中含有细胞核蛋白和RNA；

（8）提取细胞质或细胞核中的RNA的步骤如下：

a、分别取步骤（4）或步骤（7）的上清液，然后添加上清液3倍体积的试剂C，震荡混合，室温放置5~10min；

b、向步骤a得到的溶液中加入终体积20%的氯仿，涡悬震荡混匀，室温静置10min；

c、离心12000rpm×10min×4℃，将含有RNA的上清液转移到无RNase分解酶的离心管中，沉淀物中含有蛋白；

d、向步骤c得到的上清液中添加0.5~1倍体积的异丙醇，混合均匀，室温静置10min；

e、离心12000rpm×10min×4℃，保留沉淀；添加与试剂C等体积的体积浓度75%乙醇清洗沉淀；

f、离心8000rpm×5min×4℃，保留沉淀；

g、室温干燥沉淀；DEPC处理水溶解RNA；

所述细胞样品为所有人或动物来源的细胞株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（6）中试剂B的添加体积为试剂A添加体积的1/20。