[发明专利]溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒

说明书

本发明提供了溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，属于基因工程领域。本发明首次将溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白构建入原核表达载体中，得到溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白的原核表达载体，通过重组表达得到检测溶血性曼氏杆菌的抗原标志物‑PlpE蛋白，且表达的PlpE蛋白经Western Blot分析得到47KDa的目的条带。实验表明，以PlpE蛋白为抗原与大肠杆菌、链球菌、肺炎支原体三种细菌阳性血清进行免疫反应，结果发现均表现为阴性。这说明本发明提供的溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白具有良好的特异性，能够用来作为抗原标志物检测溶血性曼氏杆菌。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒。

背景技术

溶血性曼氏杆菌原名溶血性巴氏杆菌，是一种革兰氏阴性，不运动，无芽孢，氧化酶阳性，瑞士染色两极着色的兼性厌氧球杆状菌。在血液琼脂上，新分离的菌落呈微弱的β溶血。基于发酵阿拉伯糖和海藻糖的能力进一步分为两个不同的生物型(A，T)。十二个A生物型(血清型1、2、5、6、7、8、 9、12、13、14、16、17)和四个T生物型(血清型3、4、10、15)已被鉴定。溶血性曼氏杆菌是一种严重危害家畜养殖业的人畜共患病，临床上可以导致牛羊出血性败血症等危害严重的病症。一般认为它是家畜家常带内源性病菌，当饲养环境不卫生，加上由于天气的突变、寒冷、闷热、潮湿拥挤、饲养营养缺乏、饲料突变、长途运输等诱因，动物产生应激反应，机体抵抗力降低，病菌可乘机侵入机体内，经淋巴进入血液，发生内源性感染。

溶血性曼氏杆菌的检测和预防通常根据溶血性曼氏杆菌发病机理给出治疗方案，例如，溶血性曼氏杆菌含有多种毒力因子，细菌的加墨在细菌的黏附和侵入上扮演重要角色，外膜蛋白对激发机体的保护免疫应答具有重要作用，同时脂多糖和白细胞毒素能够保证溶血性曼氏杆菌能够逃避呼吸道黏膜对细菌的清楚作用，越过宿主屏障，在肺部增殖，裂解肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞加强肺的损伤。基于此，公开号为CN101014698A的专利公开了一种作为多种疫苗候选物的保守性内核脂多糖表位，通过分离脂多糖上表达的保守内核寡糖表位作为疫苗用于所述菌感染的治疗。但是目前现有技术中没有关于给出有效果检测溶血性曼氏杆菌的抗原标志物及制备，因此，本领域还没有给出免疫检测的方法的来检测溶血性曼氏杆菌。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，本发明提供所述构建方法能够制备出免疫活性高的抗原。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)以plp e-F、plpe-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的总DNA为模板进行 PCR扩增，得到PlpE蛋白编码基因的PCR产物；

所述plp e-F具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述plp e-R具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

2)将所述PlpE蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI’和 XhoI酶切，得到PlpE蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；

3)将所述PlpE蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到连接产物；

4)将所述连接产物转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌 PlpE蛋白原核表达载体。

优选的，所述步骤1)中PCR扩增的程序如下：95℃5min；95℃30sec， 56℃30sec，72℃1min，30循环；72℃7min。

优选的，所述步骤1)中PCR扩增的体系如下：