[发明专利]溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒在审
| 申请号： | 201811469487.2 | 申请日： | 2018-12-04 |
| 公开（公告）号： | CN109517832A | 公开（公告）日： | 2019-03-26 |
| 发明（设计）人： | 张月梅;赵世华;宋越;戴伶俐;王娜;刘威;张帆;杨斌;达来宝力格;陈伟 | 申请（专利权）人： | 内蒙古自治区农牧业科学院 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;C12N15/70;C07K14/195;G01N33/569 |
| 代理公司： | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人： | 刘奇 |
| 地址： | 010000 内蒙古*** | 国省代码： | 内蒙古;15 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 溶血性曼氏杆菌 蛋白 蛋白原核表达 原核表达载体 检测 抗原标志 试剂盒 构建 基因工程领域 大肠杆菌 链球菌 肺炎支原体 蛋白构建 阳性血清 重组表达 抗原 条带 阴性 细菌 表现 发现 分析 | ||
1.溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：
1)以plp e-F、plpe-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的总DNA为模板进行PCR扩增，得到PlpE蛋白编码基因的PCR产物；
所述plp e-F具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述plp e-R具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述PlpE蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI’和XhoI酶切，得到PlpE蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；
3)将所述PlpE蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到连接产物；
4)将所述连接产物转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增的程序如下：95℃5min；30循环，95℃30sec，56℃30sec，72℃1min；72℃7min。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增的体系包括如下组分：
plpE-F引物 2μl plpE-R引物 2μl 总DNA 2μl 25mmol/LdNTP 1μl 10Xpfu缓冲液 5μl 5μ/μlpfu高温聚合酶 0.4μl 2O]]> 补齐至50μl。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中连接的方法是采用T4连接酶进行连接。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述连接的体系包括如下组分：酶切目的片段的体积为8μl，酶切质粒载体的体积为4μl；10X T4DNA连接酶缓冲液的体积为2μl，5U/μl T4DNA连接酶的体积为1μl，ddH2O补充至20μl。
6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为1h。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中转化的方法为42℃热激法。
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