[发明专利]一种RAA荧光法检测华支睾吸虫的引物探针和试剂盒

说明书

本发明公开了一种RAA荧光法检测华支睾吸虫的引物探针和试剂盒，试剂盒包括引物、探针、RAA荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品。本发明的试剂盒在30‑42℃下进行等温扩增检测，5‑20min完成检测；试剂盒操作简单，配合小型仪器、携带方便，具有快速、灵敏、准确、重复性好的特点；适合基层和现场检测，具的良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，更具体的说是涉及一种RAA荧光法检测华支睾吸虫的引物探针和试剂盒。

背景技术

华支睾吸虫病(Clonorchiasis)是由于感染华支睾吸虫(Clonorchis sinensis，Cs)引起的食源性人兽共患寄生虫病，严重危害人类的健康。该病主要分布在朝鲜、韩国、越南北部、俄罗斯的少部分地区和中国的大部分地区。据统计全球约有3500万人感染该寄生虫，而这其中有1500万人分布在我国，在我国除西藏、青海、宁夏、内蒙古等尚未见报道外，其余27个省、市、自治区均有不同程度的流行，其中广东、广西、吉林、辽宁、黑龙江是重度流行区。

华支睾吸虫，又称肝吸虫，属于扁形动物门吸虫纲。华支睾吸虫的生活史涉及多个中间宿主，据报道有3个科的淡水螺可以作为华支睾吸虫第一中间宿主，它们分别是豆螺科，黑螺科和拟沼螺科，其中又以豆螺科里的纹沼螺，赤豆螺，长角涵螺为华支睾吸虫最常见的第一中间宿主，华支睾吸虫的第二中间宿主包含有近130多种淡水鱼类(涉及近16个科)，其中鲤科鱼类为主要中间宿主。淡水虾类也被证实能传播华支睾吸虫。除人以外，其他吃鱼的哺乳动物都有可能成为其终宿主，如狗、猫、猪、水貂、鼬、黄鼠狼和麝猫等，有些还可做为保虫宿主。在中国，狗和猫被认为是流行区最重要的动物宿主。与许多其他国家不同，中国农村的猫狗不是作为宠物饲养，而是半自由养殖，所以经常有机会生吃到主人丢掉的带有囊蚴的鱼内脏及其他不宜食用的部位如鳃和鳍等而感染华支睾吸虫。

华支睾吸虫成虫主要寄生于人或其他哺乳动物肝内二级以上分支的胆管内，严重感染者其胆囊、总胆管甚至胰管内也有成虫寄生。成虫的机械性损伤和分泌排泄物被认为是致病的主要因素。已有确切证据证明与华支睾吸虫感染有关的疾病包括有胆管炎、胆囊炎、胆石症、肝硬化、胆管癌、儿童生长发育障碍、消化性溃疡、胰腺炎和糖尿病等。

目前用于检测华支睾吸虫感染的主要方法是病原学检查方法，即在终末宿主粪便中检查虫卵、鱼体消化直接检查囊蚴等。虽然这些方法也被广泛应用于临床诊断和流行病学调查，但同时也暴露出不少问题。由于华支睾吸虫虫卵甚小，感染度轻时数量较少，而且排卵具有周期性，因此，粪检法易漏检，且常需重复多次。鱼的病原生物学检查方法不但需要具有丰富寄生虫分类学知识的专业人员操作，且需要特定的仪器和设备，费时、费力、繁琐、检出率不高，不适宜用于大规模的流行病学普查，所以在综合防治中的作用受到了很大限制。临床上鉴定人体感染华支睾吸虫的方法除了病原生物学方法外，还有免疫学检测方法，如皮内试验、间接血凝试验(IHA)、间接荧光抗体试验(IFAT)、对流免疫电泳试验(IGSS)、CIE和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。此外有些物理诊断工具如B超、CT、核磁共振等也可作为辅助检测工具。目前虽然有一些免疫学检测方法已应用于人体华支睾吸虫病的免疫检测，但在检测结果上存在着较高比例的假阳性、假阴性和交叉反应。近年来，随着分子生物学诊断技术的探索研究，华支睾吸虫病的诊断的敏感性、特异性得到进一步提高。等温核酸技术中的LAMP方法克服了PCR技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点，已有用于华支睾吸虫检测的报道，但LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，假阳性率也比较高。

因此，提供一种快速、灵敏、操作简便、可适用于现场检测的华支睾吸虫的引物探针和试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种RAA荧光法检测华支睾吸虫的引物探针和试剂盒，可实现在39℃条件下5-15分钟完成华支睾吸虫的检测，具有快速、灵敏、操作简便、可适用于现场检测的特点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：