[发明专利]一种胶原蛋白提取方法

说明书

本发明公开一种胶原蛋白提取方法，包括：①牛跟腱解冻，去血水、表面异物和筋膜，用溶液进行一次预处理；②步骤一处理的牛跟腱去脂肪膜，用溶液进行二次预处理；③步骤二处理完的牛跟腱冷冻后切片，用溶液进行前处理；④将前处理完的牛跟腱切片持续酶解，离心取上清制备胶原粗提液；⑤调节胶原粗提液pH，加入中性盐盐析，离心获得胶原蛋白沉淀；⑥加入磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，获得特定浓度的胶原蛋白。

技术领域

本发明涉及蛋白质加工领域，具体涉及一种胶原蛋白提取方法，原料可以为鱼皮、牛腱、鼠尾腱等富含I型胶原蛋白的动物组织。

背景技术

胶原蛋白是一种结构相似且最丰富的动物蛋白质，约占全部蛋白质含量的30％以上。其具有很强的伸张能力，是韧带，眼睛角膜(结晶形式)等器官的主要成分，也是细胞外基质的主要组成成分，在医疗领域具有十分重要的作用；并且胶原蛋白还具有使皮肤保持弹性的功效，其一旦老化，则会使皮肤出现皱纹，所以在化妆品领域也具有十分重要的作用。

到目前为止，已发现21种结构相似的胶原蛋白，其中Ⅰ型胶原蛋白含量最多，占总胶原蛋白含量的90％，也是当今临床医学用途最广的胶原蛋白。

胶原蛋白含量最丰富的组织有皮肤、骨骼、筋腱以及韧带，尤为筋腱胶原蛋白含量最高，所以目前的胶原蛋白提取一般都是通过牛跟腱为原料进行的提取，其提取体系有：酸法、碱法、酸-酶结合法，如申请号为201710196069X的专利公开的一种提取Ⅰ型胶原蛋白的方法(酸性酶法)，申请号为2017102236756的专利公开的一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法等。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种胶原蛋白提取方法，以牛跟腱为原料，采用酸-酶-盐相结合的方法，可得到特定浓度范围的胶原蛋白，且在局部百级环境下，无需通过过滤除菌工艺即可获得无菌且内毒素水平较低的胶原蛋白。提取的I型医药级胶原蛋白具有生物可降解性、组织可吸收性、生物相容性、弱抗原性，且杂蛋白含量低，亲水性强，抗张强度高。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种胶原蛋白提取方法，包括以下步骤：步骤一，牛跟腱用纯化水解冻，去血水和表面异物，用手术剪去表面筋膜，用山梨酸钾溶液超声波清洗，滤水；通过一组预处理溶液Ⅰ搅拌处理后，用山梨酸钾溶液搅拌清洗，滤干；步骤二，将步骤一处理完的牛跟腱用纯化水浸泡，用手术剪去脂肪膜；通过一组预处理溶液Ⅱ浸泡处理后，用纯化水搅拌清洗，滤干；步骤三，将步骤二处理完的牛跟腱冷冻后进行切片，并用注射用水搅拌清洗，通过一组前处理溶液浸泡处理后，用注射用水搅拌清洗，滤干；步骤四，将步骤三处理完的牛跟腱切片持续酶解，离心取上清为胶原粗提液；步骤五，将胶原粗提液的pH调至6.5-8.0，加入中性盐并搅拌形成盐析液，并在层析冰柜中放置12-24h，离心盐析液获得胶原蛋白沉淀；步骤六，重复步骤五三次，通过磷酸盐缓冲液溶解胶原蛋白沉淀，获得特定浓度的胶原蛋白。

根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的改进，步骤一的预处理溶液Ⅰ搅拌处理过程为：牛跟腱依次在乙醇溶液中搅拌2-8min，次氯酸钠与EDTA-Na₂的混合溶液中搅拌2-10min，TritionX-114溶液中搅拌10-30min。

根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，所述山梨酸钾溶液的浓度为0.1-0.5％，乙醇溶液的浓度为75％，混合溶液为0.05-0.35％的次氯酸钠与0.05-0.2％的EDTA-Na₂混合液，TritionX-114溶液的浓度为0.1-2％。

根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，步骤一中山梨酸钾清洗时间为1-10min。

根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，步骤二预处理溶液Ⅱ浸泡处理过程为：步骤一处理的牛跟腱依次在乙醇溶液中浸泡2-8min，次氯酸钠溶液中浸泡2-10min，TritionX-114溶液中浸泡10-30min。