[发明专利]一种胶原蛋白提取方法

权利要求书

1.一种胶原蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，牛跟腱用纯化水解冻，去血水和表面异物，用手术剪去表面筋膜，用山梨酸钾溶液超声波清洗，滤水；通过一组预处理溶液Ⅰ搅拌处理后，用山梨酸钾溶液搅拌清洗，滤干；

步骤二，将步骤一处理完的牛跟腱用纯化水浸泡，用手术剪去脂肪膜；通过一组预处理溶液Ⅱ浸泡处理后，用纯化水搅拌清洗，滤干；

步骤三，将步骤二处理完的牛跟腱冷冻后进行切片，并用注射用水搅拌清洗，通过一组前处理溶液浸泡处理后，用注射用水搅拌清洗，滤干；

步骤四，将步骤三处理完的牛跟腱切片持续酶解，离心取上清为胶原粗提液；

步骤五，将胶原粗提液的pH调至6.5-8.0，加入中性盐并搅拌形成盐析液，并在层析冰柜中放置12-24h，离心盐析液获得胶原蛋白沉淀；

步骤六，重复步骤五三次，通过磷酸盐缓冲液溶解胶原蛋白沉淀，获得特定浓度的胶原蛋白；

所述步骤一的预处理溶液Ⅰ搅拌处理过程为：

牛跟腱依次在乙醇溶液中搅拌2-8min，次氯酸钠与EDTA-Na₂的混合溶液中搅拌2-10min，TritionX-114溶液中搅拌10-30min；

步骤一中：

所述山梨酸钾溶液的浓度为0.1-2%，乙醇溶液的浓度为75%，混合溶液为0.05-0.35%的次氯酸钠与0.05-0.2%的EDTA-Na₂混合液，TritionX-114溶液的浓度为0.1-2%；

山梨酸钾清洗时间为1-10min；

所述步骤二的预处理溶液Ⅱ浸泡处理过程为：

步骤一处理的牛跟腱依次在乙醇溶液中浸泡2-8min，次氯酸钠溶液中浸泡2-10min，TritionX-114溶液中浸泡10-30min；

步骤二中：

所述乙醇溶液的浓度为75%，次氯酸钠溶液的浓度为0.05-0.35%，TritionX-114溶液的浓度为0.1-2%；

所述纯化水搅拌清洗时间为1-10min；

所述步骤三的前处理溶液浸泡处理过程为：

步骤二处理的牛跟腱依次在次氯酸钠溶液浸泡2-8min，磷酸三丁酯与Triton X-100混合溶液浸泡2-8min，次氯酸钠溶液浸泡2-8min，氢氧化钠溶液浸泡1-3min，TritonX-114溶液浸泡10-30min，碳酸钠溶液浸泡1-3h；TritionX-114溶液的浓度为0.1-2%；

步骤三中，

所述次氯酸钠溶液的浓度为0.05-0.35%，碳酸钠溶液的浓度为0.05-0.2%，混合溶液为0.2-0.5%的磷酸三丁酯与0.1-2%的Triton X-100混合液，氢氧化钠溶液的浓度为0.1-0.4%；

所述步骤四中的酶解过程为：

a. 酶解罐内通过0.1-2g胃蛋白酶与1-2L酸性溶液充分溶解后制得酶解液，酸性溶液可以是乙酸、柠檬酸，或酒石酸、亚酒石酸中的一种或两种，浓度为0.1-2mol/L；

b. 步骤三处理的牛跟腱50-200g放入酶解罐内，完全浸没在酶解液中；

c. 控制酶解液的pH在2.0-3.0，控制温度在2-8℃；

d. 控制酶解时间为36-48h；

所述步骤五中盐析液中中性盐浓度为0.5-1mol/L。

2.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤五中胶原粗提液的pH通过5-20%的氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸氢钠中的一种或几种完成调节；

所述中性盐为氯化钠、氯化钾中的一种或两种；

所述离心盐析液的离心转速为5000-10000rpm/min，离心时间为25-40min。

3.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其特征在于，步骤六中：

所述磷酸盐缓冲液的pH为6.9-7.4。