[发明专利]一种兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌多重PCR检测方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌多重PCR检测方法。本发明根据兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的保守基因序列设计的特异性引物，并进一步优化建立了适宜于快速准确进行兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌检测的多重PCR扩增方法。该方法可特异性地检测出混合感染的兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌，检测成本低、效率高，适用于相关临床病例的快速诊断及流行病学调查。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域技术领域，具体涉及一种兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌多重PCR检测方法。

背景技术

兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌均为革兰氏阴性菌，血清型多且宿主范围广，给养殖业带来严重的危害和巨大损失，同时也危及公共卫生安全。兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的常用检测方法有传统分离鉴定、免疫学方法、分子生物学方法等。传统分离鉴定、免疫学方法检测过程费时费力，且灵敏度较低。PCR应用已较为广泛，随着多种细菌性疾病混合感染情况的日益加重，多重PCR检测方法得到快速发展和应用，该技术检测成本低、效率高，可真正实现快速核酸检测。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌多重PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的遗传标记物，其具有SEQ ID NO.7-NO.9所示的序列。

本发明的第二方面，提供用于特异性扩增上述遗传标记物的PCR引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-NO.6所示。具体如下：

肺炎克雷伯氏菌上游引物F：5’-TTCAACAGCGACGCAGGCAGC-3’；(SEQ ID NO.1)

肺炎克雷伯氏菌下游引物R：5’-GCCGTAGTTCTTCAGCTTC-3’。(SEQ ID NO.2)

沙门氏菌上游引物F：5’-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG-3’；(SEQ ID NO.3)

沙门氏菌下游引物R：5’-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3’。(SEQ ID NO.4)

波氏杆菌上游引物F：5’-TGATCACCGGCAACATCGT-3’；(SEQ ID NO.5)

波氏杆菌下游引物R：5’-GATACGGATCTGCACTCCT-3’。(SEQ ID NO.6)

本发明的第三方面，提供上述PCR引物对在制备检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的试剂盒中的应用。

本发明的第四方面，提供一种检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的PCR引物对。

进一步的，所述试剂盒中还含有：2×Taq PCR MasterMix、模板、ddH₂O。

进一步的，所述试剂盒的工作程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。

本发明的第五方面，提供一种检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)以待测样品的菌液为模板，利用SEQ ID NO.1-NO.6所示的PCR引物对进行PCR扩增；