[发明专利]一种兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌多重PCR检测方法在审
| 申请号： | 201811459047.9 | 申请日： | 2018-11-30 |
| 公开（公告）号： | CN111254187A | 公开（公告）日： | 2020-06-09 |
| 发明（设计）人： | 黄兵;马秀丽;姜亦飞;李玉峰;于可响;刘存霞;胡峰;郭效珍;史玉颖;刘玉山 | 申请（专利权）人： | 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心） |
| 主分类号： | C12Q1/686 | 分类号： | C12Q1/686;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 250023 *** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 肺炎 克雷伯氏菌 沙门氏菌 杆菌 多重 pcr 检测 方法 | ||
1.一种用于检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的遗传标记物，其特征在于，其具有SEQ ID NO.7-NO.9所示的序列。
2.用于特异性扩增权利要求1所述的遗传标记物的PCR引物对，其特征在于，所述PCR引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-NO.6所示。
3.权利要求2所述的PCR引物对在制备检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的试剂盒中的应用。
4.一种检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求2所述的PCR引物对。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有：2×Taq PCRMasterMix、模板、ddH2O。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。
7.一种检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测样品的菌液为模板，利用SEQ ID NO.1-NO.6所示的PCR引物对进行PCR扩增；
(2)将PCR扩增的产物进行电泳，观察是否出现277bp、326bp、495bp条带；若出现277bp条带，则判断为兔肺炎克雷伯氏菌阳性；若出现326bp条带，则判断为波氏杆菌阳性；若出现495bp条带，则判断为沙门氏菌阳性；若未出现对应大小条带，则判断为对应病原阴性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，多重PCR的反应体系包括：SEQID NO.1-NO.6所示的PCR引物各0.5μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，等量混合模板3μL，ddH2O补足至50μL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，取5μLPCR产物加入2％琼脂糖凝胶中进行电泳。
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