[发明专利]用于人源粪便DNA甲基化分析的核酸纯化方法

说明书

本发明提出了用于人源粪便DNA甲基化分析的核酸纯化方法，该方法包括：将初始核酸样本进行变性处理；将变性处理产物在温度为75～80℃的条件下进行40～50分钟的转化处理，所述转化处理过程中，变性处理产物中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶仍为胞嘧啶；将转化处理产物进行纯化处理，以便获得用于DNA甲基化分析的核酸样本；其中，所述转化处理是在亚硫酸氢钠、亚硫酸钠以及保护剂存在的条件下进行的。该方法能够有效用于低含量人源DNA样本的甲基化分析，如人源粪便DNA甲基化分析，得到高转化率、高质量的转化后的DNA，有利于甲基化研究的全自动化及标准化操作。

技术领域

本发明涉及核酸纯化领域，具体地，本发明涉及用于人源粪便DNA甲基化分析的核酸纯化的方法，更具体地，本发明涉及获得用于DNA甲基化分析的核酸样本的方法。

背景技术

DNA甲基化(DNAmethylation)是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰，其主要过程是：在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins，MBDs)和DNA甲基化转移酶(DNAmethyltransferases,，DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成5’甲基胞嘧啶。

在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域、5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands，CGIs)。健康人的基因组中，CpG岛中的CpG位点一般处于非甲基化状态，而CpG岛外的CpG位点通常是被甲基化的。DNA甲基化状态与基因表达呈负相关，其调控作用主要在转录水平抑制基因的表达。

在肿瘤研究中，许多肿瘤的重要基因表达的异常主要通过DNA甲基化实现。癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化状态可导致致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高度甲基化改变，是肿瘤细胞的一个重要特征。

结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，结直肠上皮细胞更新很快，平均3－4天更新一次，正常细胞和肿瘤细胞会脱落进入肠道并随粪便排出体外，检测肿瘤细胞中的基因甲基化水平，可以方便快捷地达到辅助诊断的目的。

针对肿瘤DNA甲基化的分析方法有很多种，从基因组甲基化水平(MethylationContent)的分析就包括高效液相色谱(High-performance Liquid Chromatography，HPLC)和高效毛细管电泳法(High-performance Capillary Electrophoresis，HPCE)，这两种方法虽然能够明确检测出目的序列中所有CpG位点的甲基化状况，但并不能对甲基化位点进行定位。而对候选基因甲基化分析主要包括甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法(methylation-sensitive restriction Endonuclease-PCR/Southern，MSRE-PCR/Southern)、重亚硫酸盐测序法(BisμLphite Sequencing)、甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR，MS-PCR)、甲基化荧光法(MethyLight)焦磷酸测序(Pyrosequencing)等；除此之外，还包括差异甲基化杂交(Differential MethylationHybridization，DMH)和甲基化DNA免疫沉淀法(Methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP)等多种手段。但是研究最广泛的仍是经过重亚硫酸盐处理的方法，即需要提前将DNA进行亚硫酸盐转化后，使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不会被转化。

然而，目前市场上的重亚硫酸盐转化法还需进一步研究。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：