[发明专利]一种与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法与应用

权利要求书

1.一种与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法，其特征在于，所述CNV标记是指蛋鸡ADCY10基因候选区域的拷贝数变异。

2.如权利要求1所述的与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法，其特征在于，所述CNV标记位于ADCY10基因鸡参考基因组序列(GenBank Chromosome Z,NC_006127.5)所示序列的73664882bp-73668141bp区域内。

3.如权利要求1所述的与绿壳蛋胆绿素含量相关CNV标记方法，其特征在于，以绿壳蛋鸡基因组DNA为模板，以目标基因引物对P1(F1、R1)和参照基因引物对P2(F2、R2)为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增ADCY10基因CNV区域和对照基因，根据定量结果分析ADCY10基因CNV拷贝数，根据拷贝数高低进行绿壳蛋鸡蛋壳色素的辅助选育。

4.如权利要求1所述的与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法，其特征在于，所述的目标基因引物对P1为：

上游引物F1:CTTCAGTGCATCGGTGTGGAC

下游引物R1：CAAGGCCAAGGGCAACCTC

所述的参照基因引物对P2为：

上游引物F2:TCACAGCCACACAGAAGACG

下游引物R2：ACTTTCCCCACAGCCTTAGC。

5.根据权利要求4所述的用于鸡ADCY10基因CNV标记的引物对，其特征在于：所述目标基因引物对P1是用于定量PCR扩增ADCY10基因的拷贝数变异区域，所述参照基因引物对P2是用于扩增内参基因GAPDH的部分片段，所述内参基因GAPDH为已被证明具有稳定拷贝数的基因。

6.如权利要求1-5任一项所述的与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记在辅助绿壳蛋鸡育种中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测鸡的基因组DNA；

(2)以上述提取的鸡基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的目标基因引物对P1和参照基因引物对P2，分别进行实时荧光定量PCR扩增反应；

(3)利用2^-ΔΔCt方法计算待测样品ADCY10基因CNV片段拷贝数，将拷贝数与绿壳蛋鸡所产的绿壳蛋胆绿素含量进行关联分析；

(4)根据拷贝数高低进行绿壳性状的品种辅助选育。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：在步骤(2)所述荧光定量PCR所用的扩增体系以20μL计为：10ng/μL模板DNA 1μL、10μmol/L的上、下游引物各1μL、2x SYB Green Master10μL,ddH2O 7μL。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：在步骤(2)，所述荧光定量PCR所用的反应程序为：①预变性95℃,10min；②扩增反应95℃变性10s,60℃退火30s，39个循环；③绘制熔解曲线,95℃5s,65℃1min。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：在步骤(4)，所述所述待测鸡拷贝数高低的判断方法为：根据Log₂2^-ΔΔCt将拷贝数定量结果分为三类：；当-0.5≤Log₂2^-ΔΔCt≤0.5时，待测鸡的拷贝数变异类型属于正常型(Normal，N)，即拷贝数正常；Log₂2^-ΔΔCt<-0.5时，待测鸡的拷贝数变异类型属于缺失型(Loss，L)，即拷贝数较低；当Log₂2^-ΔΔCt>0.5时待测鸡的拷贝数变异类型属于插入型(Gain，G)，即拷贝数较高；通过拷贝数与绿壳蛋鸡所产的绿壳蛋胆绿素含量进行关联分析，得知上述拷贝数变异类型中，具有插入型(Gain，G)变异类型的个体蛋壳胆绿素含量较高。