[发明专利]一种能实现分泌表达复合肽的scAAV及方法和应用

说明书

本发明公开了一种能实现分泌表达复合肽的scAAV及方法和应用，解决现有技术中基因治疗效应性底下问题，解决了肿瘤和疑难疾病基因治疗效应和安全性兼顾问题。本发明的一种能实现分泌表达复合肽的scAAV，包含信号肽‑人工内含子‑第一表达肽‑拼接序列1‑拼接序列2‑第二表达肽‑拼接序列3‑第三表达肽‑顺反子重组表达盒；或者包含信号肽‑第一表达肽‑(GGGGS)₃(柔性连接子‑第二表达肽‑柔性连接子‑第三表达肽‑终止子的融合表达盒)。本发明通过柔性连接子分泌表达融合复合肽的scAAV技术，在同一重组病毒联合分泌表达了2种以上的治疗肽，它克服了基因治疗效应性低下问题，解决了心脑血管疾病基因治疗效应和安全性兼顾问题，为基因治疗创立新的方法学。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能实现分泌表达复合肽的scAAV及方法和应用。

背景技术

肽属于蛋白质分子的功能区序列，无论是抗原-抗体相互作用，还是激素和受体的结合及配体和受体相互作用，都是肽的和蛋白或非肽物质结合，引起的激动或阻抑作用，因此我们认为蛋白和非蛋白相互作用都是功能肽肽完成的。虽然在不同学科和领域，有多种多样的名子，但肽的理化作用机制是相同的。因为肽的分子小，渗透能力强，合成费用低，已经成为现代生物医学研究的热点之一。但是短肽在原核和真核细胞内被酶降解，也是不能表达成功的。化学合成肽随着长度增加费用加大，而且肽的稳定性差，体内半活期短，因此临床使用困难。见于肽类药物生产和使用困难，国外科学家使用非肽化合物取代肽类药方法来解决肽类药物生产和临床应用问题，目前已经有易瑞萨和特罗凯等络氨酸酶抑制剂经美国FDA批准用于临床治疗肿瘤，当然也有许多酶抑制剂，如血管紧张素酶1和2的抑制剂用于治疗高血压。使用现代随机肽文库和噬菌体文库发现确定和蛋白质相互作用的肽序列，已经成为常规方法，但是使用非肽化合物来代替生物活性肽的机能还是件复杂的结构和机能相关关系问题，因为非肽化合物和肽结构不同，体内分拣和配置就不一样，使用非肽可能带来对细胞，组织和机体毒副作用，就P53而言替代N端15肽的Nutlin已经成功了十几年，但它抗肿瘤作用不如P53N端15肽，在使用短肽治疗恶性肿瘤研究中最近使用化学合成药替代生物肽，基本原理是依据肽的和靶点间作用结构，使用化学结构类似的化学物质，通常通过药物设计软件，推测几种可能具有肽样生物活性，合成后通过生物学实验证实它的活性和安全性和体内药物代谢的动力学，如P53蛋白最早合成了Nutliny和抑制MDM2和MDM4的化合物如附图5、6所示。

虽然化学合成药替代肽已经发表大量文章，取得重要进展，如它可以适合大生产和质量控制。但是作为化学合成非肽类药，和生物活性肽结构不同，体内代谢动力学等毒负反应不一致。大量的研究还处于临床前状态。但应当看到使用合成非肽物质替代肽类药物可能是具有前景的。

生物活性肽，机能和稳定性还有缺欠，使用化学和基因添加辅助序列和结合蛋白增添必需机能，如膜渗透，靶向序列和标签序列是非常重要的。目前对GLP-1的修饰和血清白蛋白结合，大大提高了它的稳定性，使它药效学增强，使它血清半活期明显延长，是近年在肽类药物应用重大进展。治疗肿瘤短肽需要添加靶向和穿膜序列和必要的架构展示序列保证肿瘤杀伤能力。因此使用短肽肿瘤肿瘤不但是活性肽的选择，更要注重分泌表达和靶向渗透入胞的工程设计。除了肿瘤的复杂基因，RNA和蛋白质等结构和代谢紊乱之外，一些疾病也存在类似问题。如老年痴呆一方面同Aβ细胞沉积有关也同细胞内Aβ的寡聚体形成相关，也同神经元的凋亡，Tau蛋白缠结相关，因此治疗药的使用不能是单一蛋白质或DNA和RNA物质，它应当是针对各个紊乱组合体，就肽类物质而言就是复合肽的协同表达才能更好改变病理和认知障碍。我们使用了可以清除细胞外老年斑的scFv抗Aβ(1-42肽)抗体同时使用ABAD-Dp 来清除细胞内Aβ(1-42肽)寡聚体，同时为了阻断神经元的凋亡，使用神经保护肽NAP和 BDNF受体loop2的结合肽和神经细胞线粒体保护肽Humanin,这样才能够恢复老年痴呆转基因小鼠的病理和认知。所以说多靶点的复合肽治疗的有效性和安全性是良好的，这好像艾滋病使用一种抗病毒药常常是无效的，但是何大一教授使用鸡尾酒疗法挽救许多艾滋病人的生命并且一些病人可以自主生活。