[发明专利]一种双光子荧光探针及其制备和应用

说明书

本发明涉及一类在谷胱甘肽硫转移酶存在下荧光强度发生明显增强的双光子荧光探针。所述的荧光探针的结构为其中Rsubgt;1/subgt;、Rsubgt;2/subgt;为H、烷基、芳基或含杂原子的取代基。本发明提供了一种可用于双光子激发检测谷胱甘肽硫转移酶的荧光探针。本发明在具有较大双光子吸收截面的荧光母体上引入优化后的硝基苯结构作为与谷胱甘肽硫转移酶识别及反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光强度差别，实现双光子激发荧光检测谷胱甘肽硫转移酶。

技术领域：

本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一类双光子荧光探针的合成方法及其在检测谷胱甘肽硫转移酶中的应用。

背景技术：

谷胱甘肽硫转移酶(GST)是一种重要的解毒酶，它能催化谷胱甘肽(GSH)对外源性物质和内源性亲电体的亲核加成反应，生成的加合物随后会被排出体外，从而达到解毒的效果。癌细胞中GST的表达水平是决定其对化疗敏感度的重要指标。胞浆中三种重要的同工酶(A、M、P亚型)在抗药性肿瘤或肿瘤癌细胞中通常会过表达，因此，为了检测抗癌药抗性，发展能够监测哺乳动物肿瘤细胞中GST同工酶含量的高灵敏性探针是十分必要的。

目前，发展出来的检测GST活性的方法只有少数几种，比如1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)是广泛使用的一种检测试剂，但它的应用受限于低灵敏度(吸光光度法的通病)、高背景噪音和选择性差等缺点。

荧光探针技术是有效检测GST的手段之一，因为该技术相对来说技术性要求并不高，易于实用化，而且检测灵敏度高。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。Tetsuo Nagano等人公开了一种用于检测GST的荧光探针DNAT-Me(结构见图1，Tetsuo Nagano et al.，J.Am.Chem.Soc.,2008,130,14533)，该探针经GST催化与GSH加合后因为对光致电子转移效应(PeT)的抑制而使得荧光增强，从而能检测到GST的存在,但是该探针检测机制涉及的荧光性能严重依赖于环境的pH,从而在一定程度上限制了它的应用。于是后来Yuuta Fujikawa等人针对这一问题又继续开发了对pH不敏感的荧光探针3,4-DNADCF(结构见图1，Yuuta Fujikawa et al.，Chem.Commun.,2015,51,11459)。不过，上述两种探针都只对P亚型GST有特异性响应，而在实际应用中有时需要对各种同工酶具有广谱性响应的荧光探针。因而Ralf Morgenstern等人公开了一种用于检测各种GST同工酶的荧光探针DNs-CV(结构见图1，Ralf Morgensternet al.，J.Am.Chem.Soc.,2011,133,14109)，然而该探针在没有GST的催化作用下依然能与GSH发生一定程度的非酶促反应而产生较大的背景噪音。因此，开发具有更高灵敏度和信噪比的可用于生物体外水环境及生物样品如人癌细胞中的各种GST同工酶检测的荧光探针具有重要意义。

发明内容：

本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于双光子激发荧光检测生物体外水环境及生物样品如人癌细胞中的各种GST同工酶的荧光探针的制备方法及应用，此探针可以在生理条件下经β-半乳糖苷酶催化水解，所得产物荧光强度相对于原探针显著增强，同时探针与水解产物均具有双光子吸收性能，可用红外激光进行双光子激发。

本发明采用如下技术方案：在具有较大双光子吸收截面的荧光母体上引入优化后的硝基苯结构作为与谷胱甘肽硫转移酶识别及反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光强度差别，实现双光子激发荧光检测GST。所述荧光探针的通式为：