[发明专利]利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法

说明书

本发明涉及一种利用pAd‑Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法，该方法首先通过PCR技术克隆牛MEF2A基因CDS区全长序列并构建到pAdTrack‑CMV载体上，得到pAdTrack‑Mef2a基因克隆载体，然后与腺病毒骨架载体pAd‑Easy1在BJ5183感受态细胞中同源重组，组建病毒重组子pAd‑Mef2a，最后将病毒重组子pAd‑Mef2a转染到293A细胞中，经包装、扩繁、鉴定，得到高滴度的牛MEF2A基因过表达腺病毒。该牛MEF2A基因过表达腺病毒可以实现牛MEF2A基因在细胞中的高丰度表达，为今后在细胞水平上研究MEF2A的功能及其作用机制提供基础。

技术领域

本发明属于分子生物学、细胞工程技术领域，具体涉及一种利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法。

背景技术

牛肌肉的大小、生长速度、理化特性在一定程度上直接影响着牛肉的产量和品质。哺乳动物肌肉的生长发育主要包括胚胎时期肌细胞的增殖和出生后肌细胞的结构增大和肌纤维的再生，这些过程受细胞外多种因子的信号刺激以及由此引发的细胞内信号的级联反应，这些信号转导反应最终汇集于肌生成调节因子(Myogenic Regulatory Factors，MRFs)家族的表达调控，在肌肉发生过程中肌细胞增强因子2A(Myocyte Enhancer Factor2A，MEF2A)与MRFs及其他功能蛋白质相互作用，协同促进肌细胞增殖和分化过程。

目前用于实现基因表达的方法主要有基因编辑介导的基因敲入技术、质粒载体介导的基因表达、逆转录病毒载体介导的基因表达和西安并组载体介导的基因表达。真核表达载体具有细胞毒性小、安全性高等优点，但由于质粒载体很难转染大多数原代细胞细胞，并且携带的外源基因在细胞表达时间很短，难以达到实验要求。逆转录病毒具有包装速度快、表达效率高，并能够制备特定序列表达的细胞株等优点，但因其安全性较低，且只侵染处于增殖期的细胞，其应用范围也受到限制。与质粒载体、逆转录病毒载体不同，腺病毒表达载体具有安全性高、表达效率高、携带外源基因序列长、表达实效长，且能侵染处于增殖期和静息期的细胞，是一种理想的实验材料。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法，为今后在细胞水平上研究MEF2A的功能及其作用机制提供基础。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法，其特征在于，按下列步骤进行：

步骤一，在NCBI数据库中查询牛MEF2A基因序列，设计包含酶切位点在内的引物，通过PCR技术克隆牛MEF2A基因CDS全长序列；

步骤二，将牛MFE2A基因连接到pMD-19T-Simple载体上，通过转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，并挑选阳性细胞克隆进行质粒提取、测序，得到pMD-19T-MEF2A基因克隆载体；

步骤三，将牛MEF2A基因构建到pAdTrack-CMV载体上，得到pAdTrack-Mef2a，然后与腺病毒骨架载体pAd-Easy1在BJ5183感受态细胞中同源重组，组建病毒重组子pAd-Mef2a；

步骤四，将病毒重组子pAd-Mef2a转染到293A细胞中，进行腺病毒的包装、扩繁、鉴定，得到高滴度的牛MEF2A基因过表达腺病毒(命名为OE-2A)。

根据本发明，所述的引物序列如下：

上游引物(Forward primer)：

5-CGGGGTACCGCCACCATGGGGCGGAAGAAAATACAAATC-3；