[发明专利]一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，包括抗犬腺病毒Ⅱ型的单克隆抗体E1和E2、Tris‑HCl缓冲液、包被板条、层析柱、铕标记试剂、分析缓冲液和标准品。本发明采用时间分辨荧光微球作为标记物，提高了对犬腺病毒的检测灵敏度和准确度；本发明的试剂盒可以动态观察疗效和病情监测：定量检测犬腺病毒抗原浓度变化，可对CAV的病程、治疗、预后起一个动态监测的作用；本发明的试剂盒检测的批间和批内差异小，性能稳定。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其是一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒和方法。

背景技术

犬腺病毒(CAV)是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，有两个血清型。Ⅰ型可引起犬传染性肝炎和狐狸脑炎；Ⅱ型主要引起犬的传染性喉气管炎和肠炎，多可见于4月龄以下的幼犬，潜伏期为5-6天，以持续性高热(体温在39.5℃左右)、咳嗽、浆液性或黏液性鼻涕、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎为特征。CAV-Ⅱ型不仅流行于我国和世界各地家养的犬、狐中，而且广泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和浣熊等动物中。该病一年四季均可发生，各种性别、年龄和品种的犬、狐均易感染，但其中以离乳至一岁的动物，发病率和死亡率最高。病程较犬瘟热短，大约在2周内恢复或死亡，有时在数日内死亡。如与犬瘟热混合感染，则死亡率更高。患病犬及带毒犬是本病传染来源，本病主要通过消化道感染，也可通过胎盘传染。

市场上现有的检测犬腺病毒Ⅱ型的试剂盒有胶体金法。传统的胶体金法只能定性分析阳性与阴性问题，而无法做到精确定量，且检测灵敏度低。因此，建立一种可以定量检测CAV-Ⅱ型的鉴别与诊断方法具有很高的实用性和现实意义，以便尽快采取有效的治疗和防控措施，减少这些疾病对养犬业造成的危害。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，采用本发明的试剂盒和检测方法能定量检测犬腺病毒抗原浓度变化，可对CAV的病程、治疗、预后起一个动态监测的作用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：

在第一个方面，本发明提供了一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，包括抗犬腺病毒Ⅱ型的单克隆抗体E1和E2、Tris-HCl缓冲液、包被板条、层析柱、铕标记试剂、分析缓冲液和标准品。需要说明的是，单克隆抗体E1和E2均靶向抗犬腺病毒Ⅱ型的核衣壳蛋白，但是，本发明的试剂盒中采用的单克隆抗体包括但不限于E1和E2，还可以是其它能靶向结合犬腺病毒Ⅱ型核衣壳蛋白的单克隆抗体，只要该单克隆抗体具有足够的特异性和亲和力即可。其中，单克隆抗体E1和E2的亲和力可以相同，也可以有差异，但是对核衣壳蛋白的亲和力差异不得超过10％，以免导致检测误差。

优选地，所述铕标记试剂为Eu³⁺标记试剂盒。

优选地，所述层析柱为Sephadex G-50层析柱。

优选地，所述分析缓冲液为Tris-HCl、NaCl、BSA、Tween-20和NaN₃的混合溶液；更优选地，所述分析缓冲液为50mmol/L的Tris-HCl，每升分析缓冲液中还含有0.09％(W/V)的NaCl，0.02％(W/V)BSA，0.05％(W/V)Tween-20以及0.05％(W/V)的NaN₃；优选地，所述分析缓冲液的pH值为7.8。

优选地，所述标准品的制备方法为：用50mmol/L的Tris-HCl(pH 7.8)的标准品缓冲液将犬腺病毒抗原准确稀释成0，5，10，20，50，100ng/mL 6个浓度，即得，其中，所述标准品缓冲液含有0.2％(W/V)BSA和0.1％(W/V)NaN₃。

在第二个方面，本发明提供了一种犬腺病毒Ⅱ型的检测方法，包括如下步骤：

(1)向包被有抗犬腺病毒抗体E1的酶联板上加入犬腺病毒抗原标准品和待测样本；