[发明专利]一种催化效率提高的ω-转氨酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种催化效率提高的ω‑转氨酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过对ω‑转氨酶晶体结构中B因子较高的氨基酸进行定点突变，即将ω‑转氨酶32位置处的Y突变成L，得到了一种催化效率得到提高的ω‑转氨酶突变体。本发明突变体Y32L催化效率Kcat/Km提高了21.84倍，催化(R)‑phenethylamine生成acetophenone时，突变体的acetophenone最大转化率比天然酶提高了7.72倍。本发明得到的突变体比天然ω‑转氨酶更适用于在工业上的应用。

技术领域

本发明涉及一种催化效率提高的ω-转氨酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

转氨酶(aminotransferase，transaminase)属于转移酶类，通常用于催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物。根据不同可变区的差异，将文献报道的不同来源的转氨酶的蛋白质序列进行比较和聚类分析，再根据亲水位点的叠加和迭代对比，我们可以将转氨酶分为4类。其中ω-转氨酶属于第二亚族，常用于制备手性胺及非天然氨基酸，如β-氨基酸。因为ω-转氨酶的大口袋结合区域比天冬氨酸转氨酶(AspATs)和芳香族转氨酶(AroATs)稍大，所以它可能能够结合比天然氨基酸体积较大的底物。转氨酶催化的反应主要有不对称合成和动力学拆分，利用酶催化合成手性胺类化合物，不仅可以大大的提高产率，还可以避免原料的浪费，以制得大量的光学纯度较高的手性胺类化合物。ω-转氨酶不仅可以应用于对外消旋体的拆分，还可以催化前体酮底物不对称合成手性胺类化合物。ω-转氨酶在制备手性胺类化合物范围较广，因此更具有应用价值。

在蛋白质分子改造中，目前常用的方法有理性设计、非理性设计和半理性设计。三种方法的主要区别在于是否充分了解酶蛋白分子结构以及是否需要使用生物信息学软件进行计算和预测。其中理性设计具有实验成本低、简单方便和时间短等优点。

虽然ω-转氨酶有着巨大的应用和研究价值，但是从野生菌中筛选出的ω-转氨酶催化效率低，大大降低了ω-转氨酶的开发和运用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明将来自Bacillus pumilus W3的ω-转氨酶(一种来自短小芽孢杆菌的ω-转氨酶及在生物胺化中的应用.201811219769.7)进行异源表达和定点突变改造，提高ω-转氨酶对特异底物催化速率，对ω-转氨酶的规模化生产及推广具有深远的技术指导意义。

本发明的ω-转氨酶突变体，与亲本ω-转氨酶相比有更好的催化效率。所述亲本基因与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus W3)ω-转氨酶基因(Sequence ID：MH196528)一致，所述作为突变用的质粒模板为携带天然ω-转氨酶编码基因的载体ota3/pColdⅡ(申请号：CN201811219769.7)。

本发明的第一个目的是提供一种催化效率提高的ω-转氨酶突变体，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的基础上将第32位置的酪氨酸突变成亮氨酸而得到的氨基酸序列，命名为Y32L。

在一种实施方式中，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列，如SEQ ID NO:5所示的序列。

在一种实施方式中，所述ω-转氨酶突变体的核苷酸序列，包括SEQ ID NO:2所示的序列。

本发明的第二个目的是一种制备所述突变体的方法，包括如下步骤：

(1)设计定点突变所用引物，以携带ω-转氨酶编码基因的载体为模板进行突变并构建Y32L突变体的质粒载体；

(2)将序列正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌，将重组菌发酵培养，得到的发酵上清液即含有ω-转氨酶突变体。