[发明专利]一种生产丁二酸的代谢工程脱氮假单胞菌、其构建方法及其应用

说明书

一种生产丁二酸的代谢工程脱氮假单胞菌、其构建方法及其应用，属于基因工程领域和发酵工程领域，构建方法为：将脱氮假单胞菌的基因组DNA中敲除sdhAB基因和/或敲除pta‑ackA基因，并将脱氮假单胞菌来源的乙酰辅酶A合成酶基因acs在脱氮假单胞菌中过表达，将上述构建的脱氮假单胞菌以乙酸为唯一原料进行好氧发酵得丁二酸。本发明以乙酸作为原始材料，利用乙酸代谢中间产物乙酰辅酶A生物合成丁二酸，与现有技术相比，乙酰辅酶A作为代谢中间体，原料来源更广泛，成本更低。

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程领域，具体涉及一种生产丁二酸的代谢工程脱氮假单胞菌、其构建方法及其应用。

背景技术

丁二酸，一种重要的碳四平台化合物，在2004年被美国能源部确定为最具价值的生物炼制产品之一，是合成许多重要中间产物和工业化学品的前体，广泛应用于食品、医药、化学和农业上。丁二酸还可以作为中间体合成众多附加应用价值的γ-丁内酯、1，4-丁二胺、四氢呋喃等化合物。

在微生物细胞内，丁二酸是TCA循环的中间代谢产物，因此可利用生物质原料发酵法生产丁二酸。目前，微生物生产丁二酸发酵底物多为可再生资源，如葡萄糖、甘油、木质纤维素原料等物质。乙酸是一种大量而廉价的原料碳源，在我国来源丰富，主要来自于合成生物气转化，甲醇和甲烷转化。木质纤维素酸水解中产生的主要副产物也是乙酸，此外，污水污泥厌氧消化等也会产生大量的乙酸。但是目前尚未有采用脱氮假单胞菌为宿主以乙酸作为唯一碳源直接生物合成丁二酸的报道。本发明从增强底物摄取，阻断下游分解代谢方面对脱氮假单胞菌进行改造，使其能够直接利用乙酸为碳源生产丁二酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用乙酸生产丁二酸的代谢工程脱氮假单胞菌的构建方法，由上述构建方法构建的生产丁二酸的代谢工程脱氮假单胞菌工程菌株，及应用上述工程菌株菌发酵生产丁二酸的方法。

作为本发明的第一方面，提供了一种生产丁二酸的代谢工程脱氮假单胞菌的构建方法，所述构建方法为下列方法之一：

方法1：将脱氮假单胞菌的基因组DNA中敲除sdhAB基因；

方法2：将脱氮假单胞菌的基因组DNA中敲除sdhAB基因，并将脱氮假单胞菌来源的乙酰辅酶A合成酶基因acs在脱氮假单胞菌中过表达；

方法3：将脱氮假单胞菌的基因组DNA中敲除sdhAB基因和pta-ack基因；

方法4：将脱氮假单胞菌的基因组DNA中敲除sdhAB基因和pta-ack基因，并将脱氮假单胞菌来源的乙酰辅酶A合成酶基因acs在脱氮假单胞菌中过表达。

优选的，所述将脱氮假单胞菌来源的乙酰辅酶A合成酶基因acs在脱氮假单胞菌中过表达具体包括：将脱氮假单胞菌来源的乙酰辅酶A合成酶基因acs构建到大肠杆菌-假单胞菌穿梭质粒pUCPK上，得到的重组质粒pUCPK-acs，然后用pUCPK-acs转化脱氮假单胞菌，得到重组的脱氮假单胞菌。

优选的，所述假单胞菌为ATCC13867。

作为本发明的第二方面，提供了由上述构建方法所构建的代谢工程脱氮假单胞菌菌株。

作为本发明的第三方面，提供上述代谢工程脱氮假单胞菌菌株在发酵生产丁二酸中的应用。

优选的，所述发酵是以乙酸为原料进行好氧发酵。

优选的，所用发酵培养基配方为：所用发酵培养基配方为：100mmol/L磷酸缓冲液、8g/L乙酸钠、0.25g/L硫酸镁、1g/L氯化铵、1g/L酵母膏；其中，磷酸缓冲液的pH＝7.0。

本发明的有益效果：本发明以乙酸作为原始材料，利用乙酸代谢中间产物乙酰辅酶A生物合成丁二酸，与现有技术相比，乙酰辅酶A作为代谢中间体，原料来源更广泛，成本更低。

具体实施方式：