[发明专利]一种利用人参内生菌转化人参皂苷Rb1为稀有人参皂苷的方法

说明书

一种利用人参内生菌转化人参皂苷Rb1为稀有人参皂苷的方法，属于微生物技术领域，由液体培养基的配制、固体培养基的配制、人参内生菌F1的培养及将人参主皂苷Rb1转化步骤完成，最终得到稀有人参皂苷CK。本发明采用人参内生菌转化生产稀有人参皂苷CK，内生菌生长周期短、生长迅速，易于培养而不受环境因素影响，适宜工业化生产。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种人参皂苷的生产方法。

背景技术

人参(Panax ginsengC.A.Mey.)是一种特殊的药用植物，药用成分集中于人参根类部分，被世界各地草药从业者广泛用于治疗各种疾病。人参主要含有的物质包括人参皂苷、氨基酸、人参多糖、有机酸及挥发油等有效化学成分。人参皂苷是人参主要药效成分，且不同部位各单体皂苷含量有差异，以在根部中Rb₁的含量最高。其中稀有人参皂苷对抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡有重要作用。人参皂苷Compound K(简称CK)是人参二醇型皂苷在人肠道内的代谢产物，其在体内、体外均具有良好的抗肿瘤作用，是一种具有良好开发前景的抗癌新药。

植物内生菌产生与其宿主相同的化学成分，内生菌是获取植物活性成分的重要来源。内生菌在宿主的科、种以及组织水平上存在专一性。这种专一性可能是内生菌与宿主在长期共同进化中形成的。人参的名贵以及内生菌群的特殊性使得人们开始关注人参内生菌的研究。

研究表明，由于稀有人参皂苷(Rh1、Rh2、F2、CK等)具有尺寸小、生物利用度高、细胞膜渗透性强等特点，因此比人参主皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1等)具有更好的药理活性。然而，稀有人参皂苷在天然人参植物中的含量极少，因此将人参主皂苷转化为稀有人参皂苷的研究具有重要的意义。制备稀有人参皂苷的方法有化学法和生物转化法，主要采用在人参中含量较高的Rb1、Rb2、Rc、Rd等主皂苷(Majorginsenosides)分子的糖基选择性地水解制备稀有皂苷的方法。其方法主要有化学法(酸水解、碱水解、Smith降解)和生物法(酶或微生物)，其中生物转化法具有特异性高、成本低、反应条件温和、选择性高、环境友好的优点，被认为是获取稀有人参皂苷的最有效的方法。

发明内容

本发明的要解决的技术问题是提供一种利用人参内生菌转化人参皂苷Rb1为稀有人参皂苷的方法。

本发明方法包括以下步骤：

1.液体培养基的配制

取成品V8汁饮料，经离心及过滤，取上清液200-300mL，向其中加入2-4g CaCO₃，补足水至1000mL，得到液体培养基；

2.固体培养基的配制

取成品V8汁饮料，经离心及过滤，取上清液200-300mL，向其中加入2-4g CaCO₃及琼脂粉15-20g，补足水至1000mL，得到固体培养基；

3.人参内生菌F1的培养

取人参内生菌打成菌饼块，所述的人参内生菌为Fusarium oxysporum，将菌饼接种于固体培养基平板的中心，28℃培养，6-9天后刮取平板上的菌丝移到100mL液体培养基的三角瓶中，28℃、130r/min往复摇床培养8-10天，得到人参内生菌F1的培养液；

4.人参主皂苷Rb1转化方法

向含有人参内生菌F1的培养液的三角瓶中加入已灭菌的玻璃珠，再将该三角瓶放在摇床中，200rpm室温振荡1-2h，在无菌环境下过滤菌液，此菌液含有孢子；先将含有孢子的菌液按上述振荡条件下培养24h后，加入人参单体皂苷Rb₁溶液，最后使人参内生菌F1菌液的孢子最终浓度为3-5×10⁶个/mL及人参皂苷Rb1底物浓度为0.25mg/mL，继续振荡培养5-10天，得到稀有人参皂苷CK。