[发明专利]高效酶催化合成血根碱与白屈菜红碱的方法

说明书

一种高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法，其分别从已知的普罗托品‑6‑羟基化酶基因、二氢苯并菲啶氧化酶基因及细胞色素P450还原酶基因中通过异源表达和结果比对分析，筛选出表达效率高的最优基因，然后对选出的最优基因进行密码子优化；再将优化基因序列构建到表达载体上，之后转入酵母工程菌中进行转化获得重组酵母工程菌株；最后用博落回的叶片原料液前体饲喂重组酵母工程菌进行发酵，即得。本发明从基因水平、发酵工艺等多方面上提高血根碱和白屈菜红碱的酶催化效率，利用博落回的非传统药用部位叶片原料液直接与工程菌进行发酵，将叶片中生物碱含量高的原阿片碱和别隐品碱转化成高价值的血根碱和白屈菜红碱，以实现博落回资源的综合利用。

技术领域

本发明涉及血根碱和白屈菜红碱酶催化合成技术领域，具体涉及一种高效酶催化合成血根碱与白屈菜红碱的方法。

技术背景

博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)属于罂粟科博落回属植物，别名又叫号筒杆、落回、山号筒、山梧桐、三钱三等，生长于丘陵、低山、林边、草地、路旁，是一种野生草本植物。博落回主要分布于中国、东亚、北美洲和欧洲。博落回属植物包括博落回和小果博落回(M.microcarpa(Maxim)Fedde)两个种，作为一种传统中草药最早见于《本草拾遗》，在民间作为一种杀蛆青草药而广泛使用。随着研究的不断深入，发现博落回具有抑菌、抗炎、调节畜禽类肠道菌群等多重药理作用，博落回开始作为一种药源植物得到越来越广泛的应用。

博落回中含有的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和别隐品碱占博落回总生物碱的90％以上。现代药理研究表明原阿片碱、别隐品碱、白屈菜红碱和血根碱具有显著的生物活性，其中血根碱对治疗多种炎症有效，对畜禽类有较好的肠道菌群调节作用，目前已经作为饲用抗生素的替代品在欧洲等地区广泛销售。从2006年1月开始欧盟全面禁止在饲料中添加任何抗生素，导致血根碱的需求逐年增加。目前血根碱的主要来源是从博落回植株中提取，而博落回作为一种野生资源，这种获取方式导致其野生资源的存储量逐年减少。

现有的研究结果发现博落回的这4种主要生物碱在博落回中的分布呈现组织特异性。在成熟果荚中血根碱、白屈菜红碱占总碱的70％左右，原阿片碱和别隐品碱占30％左右；而在叶片中却相反，血根碱、白屈菜红碱占总碱的30％左右，原阿片碱和别隐品碱占70％左右。从生物合成途径上看(附图1)，原阿片碱和别隐品碱分别是血根碱和白屈菜红碱的前体物质，原阿片碱在普罗托品-6-羟基化酶(P6H)与辅酶基因CPR一起催化下生成二氢血根碱(DHSAN)，然后二氢血根碱(DHSAN)在二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因催化下生成血根碱(SAN)；别隐品碱在普罗托品-6-羟基化酶(P6H)与辅酶基因CPR一起催化下生成二氢白屈菜红碱(DHCHE)，然后二氢白屈菜红碱(DHCHE)在二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)基因催化下生成白屈菜红碱(CHE)。

血根碱和白屈菜红碱是博落回提取物中最主要的有效成分，在果荚中含量仅为0.5～2％左右。而叶片中的总生物碱含量大约是果荚中的50％左右，生物学产量是果荚的一倍以上。目前博落回提取物绝大部分来源于野生资源的果荚，来源有限，血根碱含量低，从而造成血根碱价格昂贵，而限制了其产业的发展。另一方面，占总生物碱很大比例的前体类物质未转化完全，在提取过程中被当成废弃物未进行综合高效利用，导致资源的极大浪费。由于每提高0.1％植株中血根碱含量可降低10％的提取成本，而传统的栽培和育种进行改良所需周期长、受环境影响大、效率低、难以大规模种植和提升潜力有限，通过现代分子生物学技术体外构建工程化菌对前体物向终产物的有效转化是获得血根碱的新药源途径。

生物转化(biotransformation)也叫生物催化(biocatalysis)，是指利用微生物全细胞或提取酶作为催化剂对外源底物进行结构修饰或定向合成而获得有价值产物的生理生化反应，其本质是生物体系中酶的催化反应。这种特定的酶催化反应具有以下特点：(1)具有高度的立体选择性。(2)反应条件温和，生产安全，不造成环境污染和后处理简单。(3)目标明确，副产物少，成本低。(4)微生物转化可以减少反应步骤。