[发明专利]高效酶催化合成血根碱与白屈菜红碱的方法

权利要求书

1.一种高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1、对参与血根碱和白屈菜红碱生物合成的基因进行密码子优化：首先根据血根碱和白屈菜红碱的生物合成途径，分别从已知的普罗托品-6-羟基化酶基因、二氢苯并菲啶氧化酶基因及细胞色素P450还原酶基因中通过异源表达和结果比对分析，分别筛选出表达效率高的最优基因，然后对筛选出的普罗托品-6-羟基化酶基因、二氢苯并菲啶氧化酶基因最优基因进行密码子优化，具体如下：

从已知的普罗托品-6-羟基化酶基因MC11229和MC11218中通过异源表达和结果比对分析，筛选出表达效率高的最优基因MC11229，然后对筛选出的最优基因MC11229进行密码子优化得到优化后的基因MC11229opt；其中：MC11229的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，MC11229opt的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，MC11218的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

从已知的二氢苯并菲啶氧化酶基因MC6408和MC6407中通过异源表达和结果比对分析，筛选出表达效率高的最优基因MC6408，然后对筛选出的最优基因MC6408进行密码子优化得到优化后的基因MC6408opt；其中：MC6408的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，MC6408 opt的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，MC6407的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

从已知的细胞色素P450还原酶基因CuCPR、PsCPR、AtCPR、Mc19967和Mc13802中通过异源表达和结果比对分析，筛选出表达效率高的最优基因CuCPR，CuCPR的核苷酸序列如SEQID No.10所示；

S2、将博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列MC11229opt与辅酶基因CuCPR、二氢苯并菲啶氧化酶基因优化序列MC6408 opt一起构建到表达载体上，然后转入酵母工程菌中，并进行转化，获得重组酵母工程菌株；

S3、将博落回的叶片原料液与步骤S3构建的重组酵母工程菌进行发酵，发酵条件为：将博落回叶片原液作为底物，前体饲喂步骤S2构建的酵母工程菌；温度30°下，发酵培养24小时；然后收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、分离纯化，即得血根碱和白屈菜红碱；

博落回叶片原液的制备方法如下：

(1)将博落回叶片放于35～45℃的恒温干燥箱中烘干，并粉碎得叶片粉末备用；

(2)然后将制得的叶片粉末按比例加入一定体积pH＝8.0的TE缓冲溶液中，配置呈一定比例的缓冲液；

(3)最后将所述缓冲液先放入高压蒸汽灭菌锅中110～120℃灭菌25～35min或者放入超声波清洗器中超声25～35min，然后4500～5500rpm离心4～6min，上清液过0.2～0.25μm滤膜，即得。

2.根据权利要求1所述的高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法，其特征在于，步骤S2中，所述表达载体的质粒选自PYES2。

3.根据权利要求1所述的高效酶催化合成血根碱和白屈菜红碱的方法，其特征在于，步骤S2中，所述酵母工程菌株的宿主菌选自酵母菌株ivf。