[发明专利]用于光漂白染色细胞的方法

说明书

本发明涉及一种用于光漂白染色细胞的方法，具体而言，一种通过用具有检测部分和抗原识别部分的缀合物标记来自细胞样品的靶部分或靶细胞，检测或鉴定所述靶部分或靶细胞的方法，其中在检测靶部分之后，检测部分通过用光辐射而降解，从而能够进行随后的标记和检测；以及该方法在荧光显微术、流式细胞仪、荧光分光光度法、细胞分离、病理学或组织学中的用途。

技术领域

本发明涉及通过用具有检测部分和抗原识别部分的缀合物标记来自细胞样品的靶部分或靶细胞，检测或鉴定所述靶部分或靶细胞的方法，其中在检测靶部分之后，检测部分通过用光辐射而降解，从而能够进行随后的标记和检测。

背景技术

与一种或多种抗体缀合的荧光染料通常用于免疫荧光分析。在过去二十年中，在抗体、荧光染料、流式细胞仪、流式分选仪和荧光显微镜方面已经开发了大量变型，以能够进行靶细胞的特异性检测和分离。

已知利用荧光染料来分离或检测靶细胞，荧光染料可在检测后被除去或破坏。例如，US7776562公开了一种基于用可逆肽/MHC-多聚体或Fab-Streptamer间接、非共价标记靶细胞的可逆荧光标记方法。

为了减少检测后的荧光辐射，GB2372256公开了一种通过提供包含多个经过接头连接到抗体的荧光染料的缀合物来猝灭荧光辐射的方法。高密度的荧光染料将猝灭荧光信号。此外，GB2372256描述了酶促降解接头以从缀合物释放荧光染料。释放的荧光染料不经历自猝灭，导致更强的荧光信号，即更好的分辨率。

消除荧光信号对于基于顺序染色样本的免疫荧光技术是必要的。与使用同时标记和检测的标准程序相比，这些技术已显示出提供更高的多路复用潜力。然而，这些技术基于通过化学漂白程序氧化破坏缀合的荧光部分(US 7741045 B2、EP 0810 428 B1或DE10143757)，或者在基于光漂白的方法的情况下，漂白速率比这里提出的方法更慢。

现有技术的主要目的是提供染料或包含所述染料的缀合物，该染料发射尽可能强的荧光辐射，即，具有最大量子产率。为了提供可靠和可再现的信号，染料被设计成尽可能稳定。虽然这些性质对于细胞检测和细胞分离(如FACS过程)是有利的，但它们阻止细胞重复染色和检测。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种增强的方法，该方法用于特异性标记和检测生物样本的样品之中或之上的靶标，并随后降解检测部分，以便能够进行进一步标记和检测循环。

令人意外地发现，缀合物由通过间隔基与检测部分连接的抗原结合部分组成，所述检测部分具有更高的量子产率(并因此具有更高的亮度)和降低的光稳定性二者，如果间隔基是提供有多个低聚物PEG侧链(即，一定的支化程度)的支链PEG低聚物或多聚物，并且检测部分共价连接于该支链PEG，则检测部分可以容易地被光降解。不受该理论的束缚，据信支链PEG低聚物或多聚物“包裹”与其共价连接的检测部分，导致更紧密的接触和更高的量子产率，以光诱导氧化破坏检测部分。

因此，本发明的目的是用于检测生物样本的样品中的靶部分的方法，做法是：

a) 提供至少一种具有通式(I) X_n – P – Y_m的缀合物，其中X是荧光部分，Y是抗原识别部分，n、m是1和100之间的整数，P是包含根据通式I的聚乙二醇的间隔基

(R₇CH₂CHR₅O)-(CR₁R₂CR₃R₄O)_o-(CH₂CHR₆R₈) (I)