[发明专利]一种泪腺干细胞、泪腺干细胞的培养体系和培养方法

说明书

本发明涉及一种泪腺干细胞、泪腺干细胞的培养体系和培养方法，涉及细胞工程领域。本发明的泪腺干细胞的培养体系以DMEM/F12为基础培养基，添加以下组分构成培养液：细胞培养添加剂、非必需氨基酸、L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺、丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路配体、成纤维细胞生长因子、Wnt信号通路配体和ROCK信号通路抑制剂的组合物，并以基质胶作为立体培养的支架。本发明的培养方法为，将小鼠泪腺组织消化成单细胞接种到基质胶中，待其凝固后，加入上述泪腺干细胞培养液中进行原代培养。采用本发明的方法培养的小鼠泪腺干细胞，数量较多，够稳定持续传代，并且具备恢复泪腺分泌功能的作用，可有效治疗干眼症。

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，特别是涉及一种三维立体培养体系及采用此培养体系培养的小鼠泪腺干细胞(LGSC)。

背景技术

泪腺是眼部重要器官，主要由分泌腺泡和分泌管组成。泪腺受到交感神经和副交感神经调节，其中大部分是胆碱能神经，少部分是肾上腺素能神经。交感神经源自颈上神经节，副交感神经则与翼腭神经节和睫状神经节相连接，并且泪腺的某些感觉神经与三叉神经相连。泪腺中有多种乙酰胆碱受体，包括毒蕈硷受体、I型和II型血管活性肠肽受体及去甲肾上腺素受体α1、β。神经调节下泪腺能分泌溶菌酶，乳铁传递蛋白，脂质运载蛋白，免疫球蛋白A等。

泪腺分泌眼泪，形成泪膜，使眼睛保持湿润，以保护眼睛。一旦泪腺病变或受到损伤，眼泪分泌不足，人就会患上干眼症(Dry eye Disease,DED)。人的衰老、自身免疫系统的紊乱、眼部的放疗、以及雄性激素水平的降低都会引起泪腺功能失调。干眼症患者所分泌形成的泪膜比正常泪膜渗透压高，从而引起角膜炎症，导致角膜细胞受损、形成溃疡，最终导致患者视力下降，严重影响其生活质量。

对于干眼症患者，目前的药物治疗方案主要有点滴等渗或低渗的眼药水，抑制因干眼症引起的眼结膜和角膜的炎症发生，阻塞泪孔增加泪膜厚度等。但这些治疗只能缓解干眼症的症状，使眼睛尽可能地保持湿润，避免角膜细胞受到损伤。而且，长时间使用眼药水和抗炎症药物，也会杀伤角膜细胞并且引发更难治愈的炎症反应。因此，药物治疗并不能从根本上解决泪腺分泌功能失调的问题，不能彻底治愈老化或者病变的泪腺。

为了更有效更彻底地治疗干眼症，研究者们开展了一系列研究，旨在恢复泪腺的分泌功能。要完全恢复泪腺的分泌功能，就需要获得新的健康细胞或者器官进行移植治疗。为了得到用于移植的泪腺细胞，研究者便开始尝试体外分离培养泪腺干细胞。经过近三十年的努力，泪腺干细胞的体外培养有了突破性的研究，然而，现有的泪腺干细胞体外培养方法分选祖细胞的效率非常低、数量少，并且不能持续传代培养，大大限制了其临床应用。因此，需要更加优良的分离方法和培养体系来分离和培养泪腺干细胞，为临床应用提供良好的技术平台。

发明内容

基于此，有必要针对现有的泪腺干细胞培养体系和培养方法分选祖细胞效率低、数量少的问题，提供一种泪腺干细胞的培养体系和培养方法，以获得较多数量的泪腺干细胞，并且该泪腺干细胞能够进行稳定的传代培养。

一种泪腺干细胞的培养体系，以DMEM/F12为基础培养基，添加以下组分构成培养液：细胞培养添加剂、非必需氨基酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路配体、成纤维细胞生长因子、Wnt信号通路配体和ROCK信号通路抑制剂的组合物，并以基质胶作为立体培养的支架。

进一步地，所述细胞培养添加剂为N2和B27的混合物。

所述细胞培养添加剂也可以选用9F，由β-巯基乙醇、2-氨基乙醇、亚硒酸钠、肝素、转铁蛋白、维生素C、胰岛素、牛血清白蛋白-油酸和成纤维细胞生长因子-2(FGF2)组成。

进一步地，所述丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路(MAPK/ERK信号通路)配体为EGF，所述成纤维细胞生长因子为FGF10，所述Wnt信号通路配体为Wnt3A，所述ROCK信号通路抑制剂为Y-27632。