[发明专利]一种发酵液中3-羟基丁酮定量测定的方法

说明书

本发明公开了一种发酵液中3‑羟基丁酮定量测定的方法，属于分析检测领域。本发明方法具体为：含3‑羟基丁酮的发酵液耗尽葡萄糖后，加入3,5‑二硝基水杨酸试剂，并与发酵液共沸，反应完毕后，检测溶液吸光度，溶液吸光度与发酵液中3‑羟基丁酮的浓度在一定范围内呈线性关系；检测的吸光度数值代入标准曲线的线性方程，即可获得发酵液中3‑羟基丁酮的浓度。本发明检测发酵液中3‑羟基丁酮含量的方法，对设备要求不高，成本低，检测速度快，适合大批量样品的检测，显著降低菌株选育过程中产物检测的工作量。

技术领域

本发明涉及分析检测领域，特别涉及一种发酵液中3-羟基丁酮定量测定的方法。

背景技术

3-羟基丁酮化学命名为3-羟基-2-丁酮，是一种α-羟基酮，分子式为C₄H₈O₂，分子量88.12，分子内2、3位碳为不对称碳原子，有两个手性异构体，其化学结构式是：

3-羟基丁酮单体是淡黄色或无色液体，呈现奶油香味，在低温下，两分子3-羟基丁酮聚合成二聚体，其为白色结晶粉末。3-羟基丁酮的沸点是148℃，熔点是15℃，可自燃，溶于丙二醇、乙醇，混溶于水，微溶于乙醚，不溶于植物。

3-羟基丁酮质量指标（FCC，1981）：含量≥96.0%，折射率（nD20）1.417～1.42，相对密度（d2525）1.005～1.019。毒性GRAS（FEMA；FAD，§182.60，1994），TDL012.6g/kg（大鼠，经口）。3-羟基丁酮属于α-羟基酮，化学性质活泼，具有典型的α-羟基醛酮的化学性质。能被高碘酸氧化生成乙醛和乙酸；可以发生成脎反应，与苯肼作用生成脎；可以发生仲醇氧化反应生成双乙酰。

3-羟基丁酮（acetoin；Acetylmethylcarbinol；3-hydroxy-2-butanone）又名乙偶姻、甲基乙酰甲醇，是一种国际上常用的香料品种，自然存在于葡萄、苹果、可可、香蕉、肉类、干酪、玉米等许多水果、食品和作物中。3-羟基丁酮具有令人愉快的奶油香味，美国食品和萃取协会（FEMA）已批准在食品中使用，CAS号513-86-0，FEMA安全号为2008。我国GB2760-86规定允许食用[3]，多用于奶油、干酪、咖啡、果实的香味增强剂以及奶油、乳品、酸奶和草莓型香精的生产等，是乳类发酵制品风味组成的主要成分，并且与啤酒、葡萄酒以及中国传统白酒的风味有关。另外，3-羟基丁酮是一种4C平台化合物，被广泛应用于众多行业，美国能源部在2004年将3-羟基丁酮列为 30 种优先开发与利用平台化合物之一。3-羟基丁酮被广泛应用于食品、香料以及化妆品等行业，作为医药合成中间体在化工合成等领域也具有广阔的应用前景。近几年来，随着3-羟基丁酮需求量的不断增长，其生产技术研究引起人们广泛关注。

目前，3-羟基丁酮以2,3-丁二酮或2,3-丁二醇为原料由化学合成法生产为主，该方法由于存在原料来源受限、工艺复杂、污染严重、生产成本高、产品质量安全差等不足，应用受到一定的限制。生物法生产3-羟基丁酮具有原料来源丰富、工艺条件温和、环境友好、产品安全等优点，符合当今倡导的环保、绿色制造工艺的理念，生物法生产3-羟基丁酮是最具发展潜力的方法，因此，开展发酵法生产3-羟基丁酮技术的研究具有重要的现实意义和使用价值。

现阶段对发酵液中的3-羟基丁酮进行定量检测的方法主要有肌酸比色法、气相色谱(GC)法和液相色谱(HPLC)法。

肌酸比色法的检测原理是：在碱性介质中，3-羟基丁酮与含胍基的化合物反应生成红色化合物，甲萘酚的存在可以促进并加速红色物质生成，该化合物在500~600nm范围内有光吸收，其吸光度在一定浓度范围内与3-羟基丁酮浓度成正比，利用3-羟基丁酮的这一化学特性，选择肌酸比色法对发酵液中的3-羟基丁酮进行了定量检测，但是肌酸比色法有一个缺点是检测试剂必须现配现用，既耗时耗力又经常造成试剂的浪费。