[发明专利]一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法

说明书

本发明公开了一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，具体包括设计检测引物、检测体系的配制、扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。本发明提供了一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，利用大肠杆菌表达系统可以轻易获得高纯度的klenow(exo‑)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低，将klenow(exo‑)蛋白结合RAA快速扩增技术能大幅度提高对SNP位点的特异性鉴别。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，特别是涉及一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法。

背景技术

随着测序技术的不断发展人们对于单碱基多态性的重要性有了深入的了解，作为一种遗传变异的分子标记，其对于遗传病研究，药物开发等医药治疗领域及生物学，农学等基础学科都有着广泛的影响。目前关于SNPs的检测技术发展迅速。

重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA技术)，是一种利用体内扩增技术实现在核酸体外快速扩增的新型扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。RAA技术能在常温下以较短的时间实现核酸快速扩增，扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳或实时荧光检测实现目的基因的快速检测。

Klenow(exo-)是一种中温聚合酶该酶采用突变方式去除了校正核酸酶活性(3’-5’)和(5’-3’)缺口平移酶活性具有链置换活性。

因此提供一种将klenow蛋白应用于RAA技术的方法，大幅度提高在SNPs检测中的特异性是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，利用大肠杆菌表达系统可以轻易获得高纯度的klenow(exo-)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低，将klenow(exo-)蛋白结合RAA快速扩增技术能大幅度提高对SNP位点的特异性鉴别。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中应用。

进一步地，利用klenow(exo-)蛋白作为所述RAA检测体系中的聚合酶，能够有效提高对SNP位点的特异性检测。

一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，具体步骤如下：

(1)质粒模板为SEQ ID NO.12，设计检测引物如下：

Sal F：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCT；SEQ ID NO.1；

Sal R：GAGCGCTTCCATAATTAATTTCATATTACGCACGG；SEQ ID NO.2；

SalmF_双：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTAG；SEQ ID NO.3；

SalmF_单：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCG；SEQ ID NO.4；

(2)检测体系的配制