[发明专利]一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法在审
| 申请号： | 201811409926.0 | 申请日： | 2018-11-23 |
| 公开（公告）号： | CN109504748A | 公开（公告）日： | 2019-03-22 |
| 发明（设计）人： | 程奇;孙文丽 | 申请（专利权）人： | 浙江善测禾骑士生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6858 | 分类号： | C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 李冉 |
| 地址： | 314000 浙江省嘉兴*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 扩增 琼脂糖凝胶电泳检测 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌系统 特异性鉴别 蛋白结合 检测引物 目的蛋白 表达量 高纯度 生产成本 配制 蛋白 检测 | ||
1.klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中应用。
2.根据权利要求1所述的klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中应用，其特征在于，利用klenow(exo-)蛋白作为所述RAA检测体系中的聚合酶，能够有效提高对SNP位点的特异性检测。
3.一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)质粒模板为SEQ ID NO.12，设计检测引物如下：
Sal F：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCT；SEQ ID NO.1；
Sal R：GAGCGCTTCCATAATTAATTTCATATTACGCACGG；SEQ ID NO.2；
SalmF双：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTAG；SEQ ID NO.3；
SalmF单：GATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCG；SEQ ID NO.4；
(2)检测体系的配制
50ul扩增反应体系包括50pm上下游引物，5％PEG 35K，1ul模板，反应液，加水至50ul；其中，反应液的组分为55mM Tris；12mM二硫苏糖醇；12mM磷酸肌酸二钠盐、114ng/uL磷酸肌酶、75mM乙酸钾、490uM dNTPs、3.5mM ATP、6％海藻糖、7％甘露醇、5％PEG35000、0.28ug/uL重组酶、0.08ug/uL辅助蛋白、0.3ug/uL单链结合蛋白、0.11ug/uL klenow(exo-)蛋白、105Mm KAc和200nM Pro-U；
(3)扩增
在步骤(2)的所述扩增体系中，加入100-120mmol/L醋酸镁激活反应，并在37℃条件下，反应25-45min后，再加入50-60ul体积比为1:1的酚-氯仿溶液结束反应；
(4)琼脂糖凝胶电泳检测
将步骤(3)中扩增结束后的反应液进行离心，其中最上层上清为扩增产物，将所述扩增后产物以1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
4.根据权利要求3所述的一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法，其特征在于，步骤(4)所述离心方法为：12000rpm，离心5-10min。
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