[发明专利]一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法与应用。本发明利用DNA组装技术和组成型启动子驱动的过表达策略，实现了大环内酯类生物杀虫剂多杀菌素的高效异源表达。本发明将多杀菌素合成途径中的23个基因按功能分为五组，分别置于不同组成型强启动子的控制下，构建了102.6kb的人工基因簇，经反转录PCR分析，多杀菌素生物合成的23个基因共分为7个操纵子，与原始基因簇相比，人工基因簇在异源宿主白色链霉菌J1074中的多杀菌素产量提高了328倍。本发明建立的多操纵子人工基因簇策略为次级代谢产物的合成生物学研究提供了新方法。

技术领域

本发明涉及一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

多杀菌素(spinosyn A和D的混合物)是由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经次级代谢产生的一种高效广谱的大环内酯类生物杀虫剂。多杀菌素由一个21碳四环内酯骨架、一个福乐糖胺残基和一个鼠李糖残基三部分构成。刺糖多孢菌发酵产生的多杀菌素类化合物中，含量最高是spinosyn A和D。由于多杀菌素的杀虫机制独特，对哺乳动物毒性低，而且在环境中能较快的被降解等优势，在1999年获得美国“总统绿色化学挑战奖”。

在刺糖多孢菌中，多杀菌素的生物合成共涉及23个基因，其中19个基因成簇排列在74kb的基因簇中：包括聚酮合酶基因spnA，spnB，spnC，spnD和spnE；聚酮交联基因spnF，spnJ，spnL和spnM；福乐糖胺合成基因spnO，spnN，spnQ和spnR；福乐糖胺甲基转移酶基因spnS；鼠李糖基转移酶基因spnG；福乐糖基转移酶基因spnP以及三个鼠李糖甲基化酶基因spnH，spnI和spnK。负责TDP-L-鼠李糖合成的四个基因(gtt，gdh，epi和kre)分散分布在染色体的3个位点上。在刺糖多孢菌中，次级代谢途径与细胞壁合成共用一套鼠李糖合成基因。另外，gtt和gdh基因也同时催化TDP-福乐糖胺合成途径的前两步反应。Spinosyn A的生物合成起始于聚酮合酶和交联酶催化9个乙酸单位和2个丙酸单位缩合交联生成21-碳四环糖苷配基。随后，TDP-鼠李糖连接到糖苷配基上，并被三氧甲基化形成拟糖苷配基。最后，二甲胺基福乐糖胺连接到拟糖苷配基生成spinosyn A。Spinosyn D和A的区别是C6上的取代基不同，spinosyn D为CH₃，spinosyn A为H，这是因为聚酮合酶的第八个延伸模块的酰基转移酶在合成spinosyn D时结合丙酸单位，而在合成spinosyn A时结合乙酸单位。迄今为止，已从刺糖多孢菌发酵液中分离鉴定到了20多种多杀菌素衍生物，它们在两个脱氧糖基和四环内酯骨架上各有不同的取代模式。