[发明专利]一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法与应用

权利要求书

1.一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）以刺糖多孢菌DSM44228的基因组DNA为模板，XbaI、HpaI双酶切得71.3kb XbaI-HpaI片段和19.4kb HpaI片段，将71.3kb XbaI-HpaI片段克隆到pBeloBAC11载体构建得重组质粒载体pBAC-spn71XH；将19.4kb HpaI片段克隆到pBR322-amp载体构建得重组质粒载体pBR322-spn19H；

所述71.3kb XbaI-HpaI片段包括多杀菌素生物合成基因spnA，spnB，spnC，spnD，spnE，spnF，spnJ，spnL，spnM，spnO，spnN，spnQ，spnR，spnS，spnG，spnP，spnH，spnI和spnK；所述19.4kb HpaI片段包括spnE基因的部分片段；

（2）将鼠李糖合成基因gtt，gdh-kre，epi和卡那霉素抗性基因neo克隆到pBR322-amp载体构建得重组质粒载体pBR322-Rhaneo；将pBR322-Rhaneo与步骤（1）中的pBR322-spn19H重组得重组质粒载体pBR322-spnERhaneo；

（3）将步骤（1）中得到的pBAC-spn71XH与步骤（2）得到的pBR322-spnERhaneo重组得含有完整多杀菌素生物合成基因簇的BAC载体pBAC-spn；将apra-oriT-attP-phiC31int基因盒与pBAC-spn经重组得大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pBAC-spn-phiC31-apra；

（4）将多杀菌素生物合成基因spnJ，spnM，spnF，spnL，gtt，gdh，epi，kre，spnG，spnI，spnK，spnH，spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR，spnS，白色链霉菌J1074的组成型强启动子SA15p，SA2p，SA6p，SA31p，SA13p，氯霉素抗性基因cm，与pBR322-amp-ccdB载体经多片段组装得重组质粒载体pBR322-spnFSRhaNEW；所述spnO、spnN、spnQ、spnR、spnS在组成型强启动子SA13p的控制下形成操纵子；所述spnI、spnK、spnH、spnP在组成型强启动子SA31p的控制下形成操纵子；所述gtt、gdh、epi、kre、spnG在组成型强启动子SA2p的控制下形成操纵子；所述spnJ、spnM、spnF、spnL在组成型强启动子SA6p的控制下形成操纵子；所述cm位于组成型强启动子SA6p的上游，并与组成型强启动子SA15p串联；每个操纵子中，基因按照参与多杀菌素生物合成的顺序排列；

（5）以氨苄青霉素抗性基因amp和潮霉素抗性基因hyg分别替换步骤（3）中pBAC-spn-phiC31-para中的spnF-spnS基因和鼠李糖合成基因得重组质粒载体pBAC-spnAE-hyg-amp，将步骤（4）得到的pBR322-spnFSRhaNEW插入到pBAC-spnAE-hyg-amp中spnA的上游，spnA的上游为pBR322-spnFSRhaNEW中的组成型强启动子SA15p，得到含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒pBAC-spnNEW。