[发明专利]水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用

说明书

本发明公开了水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用，属于生物化学技术领域。本发明还提供了一种长粒型种子水稻的育种方法，包括：利用CRISPR/Cas9技术定点编辑所述水稻OsARF6基因的靶位点，所述靶位点的序列分别为：GACGCTGCAGCCACTCAGCC，ACCACTGGCTAAATATGTAA。本发明利用CRISPR/Cas9系统构建水稻OsARF6基因靶位点特异性敲除的植物重组表达载体，利用转基因获得OsARF6纯合稳定的突变体植株，可用于分析OsARF6基因在水稻中的生物学功能；本发明还提供了水稻OsARF6突变体植株在水稻粒型研究的新方向，在农业开发方面具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用。

背景技术

CRISPR/Cas9是新发展起来的一项有着巨大影响力的基因编辑技术，其简单的操作以及广泛的应用而受到青睐。CRISPR/Cas9体系中的载体主要由两大元件构成：sgRNA(single guide RNA)以及Cas9。sgRNA是一种非编码的小RNA，由U3或者U6启动子启动。Cas9编码核酸酶蛋白，分子量大于1000个氨基酸，可以切割DNA核酸序列。CRISPR/Cas9体系主要借助sgRNA来匹配到基因组的特定位置(靶点)，之后Cas9核酸酶将此处DNA切断，形成双链切口。在DNA损伤修复过程中，无论是同源重组修复(Homologous recombination-basedrepair,HR)还是非同源末端连接修复(Nonhomologous end-joining,NHEJ)，都会在切口处引入突变。

目前CRISPR/Cas9系统已成功在拟南芥、烟草、甜橙、水稻、小麦、高粱、玉米以及苔藓植物地钱等植物中实现了定点基因组编辑，但对水稻育种中有重要价值的产量、品质、育性等关键基因的定向编辑的研究鲜有报道。

公告号为CN 105063061 B的专利文献公开了一种水稻千粒重基因tgw6突变体及其制备方法与应用。本发明通过设计特定的TGW6位点，利用CRISPR/Cas9技术定点编辑了调控水稻千粒重的TGW6基因，获得了一套具有重要应用价值的水稻tg w6缺失突变体新种质，该类突变体显著影响水稻的千粒重，提高水稻千粒重5％以上，可以用于水稻的高产、稳产育种。

生长素响应因子ARF基因是一类调控生长素相应基因表达的转录因子，他与生长素响应元件特异性结合，促进或抑制基因的表达。植物ARF由三个结构域组成氨基端的结合结构域(DBD)，中间结构域(MR)，以及羟基末端的二聚结构域(CTD)。中间结构域包括激活结构域(AD)和抑制结构域(RD)。ARFs是一大类基因家族，不同的ARF在不同的组织和器官中都有特异性的表达。

水稻是我国的主要粮食作物，利用生物信息学分析，水稻中有24个OsARF基因，目前发现OsARF4参与调控水稻的粒型，OsARF6则通过调控下游基因FZP的表达来调控水稻花序次生枝梗数量。但是关于OsARF6对水稻粒型方面的影响还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可调控水稻种子粒型的基因，通过基因改造达到改良水稻种子粒型的目的。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种CRISPR/Cas9基因编辑敲除系统，对OsARF6基因进行编辑，研究发现，对OsARF6基因进行编辑获得的阳性纯合株系，表现出粒型变长的表型，表明OsARF6基因的重新编辑在改良水稻粒型中具有一定应用价值。

因此，本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用。

具体地，利用RNAi或CRISPR/CAS9技术降低水稻OsARF6基因编码蛋白的表达或活性，进而获得长粒型种子的水稻突变体。