[发明专利]水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用

权利要求书

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，利用RNAi或CRISPR/CAS9技术降低水稻OsARF6基因编码蛋白的表达或活性，进而获得长粒型种子的水稻突变体。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水稻突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

4.一种长粒型种子水稻的育种方法，其特征在于，包括：利用CRISPR/Cas9技术定点编辑核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsARF6基因的靶位点，所述靶位点的序列分别为：GACGCTGCAGCCACTCAGCC，ACCACTGGCTAAATATGTAA。

5.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)针对所述的靶位点和pGTR质粒序列分段设计PCR引物，以pGTR质粒为模板进行PCR扩增，获得含有pGTR质粒不同分段的PCR产物，将PCR产物回收并连接获得含所述靶位点序列的线性化片段；

(2)以线性化片段为模块，PCR扩增获得含所述靶位点序列的目标产物，将目标产物连入终载体pRGEB质粒，构建得到CRISPR/Cas9重组载体；

(3)将CRISPR/Cas9重组载体转入待基因编辑的受体水稻中，培育，筛选获得含有Cas9序列标签的T0代阳性苗；

(4)T0代阳性苗自交一代得到T1代苗，通过筛选获得Cas9标签去除的T1代苗，即得具有长粒型种子表型的水稻植株。

6.如权利要求5所述的育种方法，其特征在于，步骤(1)中，设计引物时，引入酶切位点，PCR扩增得到P1、P2、P3，利用酶切产生粘性末端，在连接酶的作用下连接得到线性长片段，采用的PCR引物为：

P1：

L5AD5-F：5’-CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG-3’；

gR3-R：5’-ATGGTCTCAGGCTGCAGCGTCTGCACCAGCCGGGAA-3’；

P2：

gR3-F：5’-TAGGTCTCCAGCCACTCAGCCGTTTTAGAGCTAGAA-3’；

gR4-R：5’-CGGGTCTCATTAGCCAGTGGTTGCACCAGCCGGG-3’；

P3：

gR4-F：5’-TAGGTCTCCCTAAATATGTAAGTTTTAGAGCTAGAA-3’；

L3AD5-R：5’-TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG-3’。

7.如权利要求5所述的育种方法，其特征在于，步骤(2)中，设计的PCR引物为：

S5AD5-F：5’-CG GGTCTC A GGCA GGATG GGCAGTCTG GGCA-3’；

S3AD5-R：5’-TA GGTCTC C AAAC GGATG AGCGACAGC AAAC-3’。