[发明专利]一种羊肚菌原生质体的制备方法

说明书

本发明属于真菌的生物学领域，具体公开了一种羊肚菌原生质体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：S1、制备菌丝体培养基；S2、制备再生培养基；S3、培养菌丝体；S4、原生质体的制备；S5、原生质体纯化；S6、原生质体再生。本发明方法所述原生质体制备过程中以四氢吡啶为渗透压调节剂，谷胱甘肽为原生质体保护剂，在一个高渗的环境中加入复合酶进行破壁处理，起到双层协同保护原生质体免于膨胀破裂的作用，本发明方法，工艺简单，便于操作，可重复性强。

技术领域

本发明属于真菌的生物学领域，具体涉及一种羊肚菌原生质体的制备方法。

背景技术

羊肚菌(Morchella.spp)是子囊菌中著名的食、药用珍稀真菌资源，分类上属于子囊菌亚门、盘菌纲、盘菌目、马鞍菌科、羊肚菌属(Morchella)，其子实体和菌丝体因富含鲜味物质而出名。羊肚菌的菌丝体含有丰富的氨基酸及其它矿质营养元素，特别是人体必需氨基酸含量比较高，其中决定鲜味和营养功能的谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸的含量尤为突出，还含有胱氨酸、赖氨酸、精氨酸，可促进儿童生长与智力，支链氨基酸有利于多种肝脏病的防治。羊肚菌发酵液及菌丝体动物实验表明，其菌丝中含有的菌多糖、硒元素、有机锗在提高动物免疫、抗肿瘤过程中起着重要的作用。

原生质体为脱去细胞壁的细胞，在原生质体制备过程中，人为使细胞壁降解，去除原有细胞壁后，得到仅有细胞膜包裹着的圆球状对渗透压敏感的原生质体。在食用菌等的丝状真菌中在原生质体形成的过程中，由于长丝状的菌丝使细胞断裂后细胞膜包裹细胞的不同部位和大小，使得形成的原生质体呈单(细胞)核，双核或多核以及无核，再生后可得到单核体和双核体菌丝。因此，食用菌原生质体的制备在育种中可用于双核菌株的单核化、杂交育种及原生质体融合育种等，对无性系菌株进行再生、复壮等，作为转化系统的受体等的应用。并且食用菌双核体菌丝特殊的异核体现象使得原生质体制备在食用菌的遗传育种中可发挥最大的作用。目前，对食用菌原生质体制备技术以及理论和应用上都取得了很大的进展。多年以来，已有50多种食用菌中被报道进行了原生质体的制备，并利用制备的原生质体进行食用菌遗传、育种等研究。可以说原生质体制备方法，是推动食用菌科研和产业发展不断进步的重要技术之一，是食用菌遗传育种不可获取的研究手段。

CN201610165040.0公开了一种羊肚菌原生质体的高效制备方法，包括以下步骤：(1)收集新鲜羊肚菌孢子后置于液体培养基中培养，液体培养基是在常规PD培养基的基础上添加CuCl₂；(2)培养4-6天后，离心收集菌体，再使用PBS缓冲液重悬菌体；(3)将重悬后的菌体与石英砂混合后，振荡；(4)将震荡后的菌体过滤2次；(5)收集过滤液离心处理，菌体用PBS缓冲液洗涤2次后，再重悬于PBS缓冲液中；(6)向重悬液中添加溶壁酶、蜗牛酶，30℃处理1-3h；(7)将酶处理后的细胞于离心处理，沉淀经ZnCl₂溶液洗涤后，重悬于ZnCl₂溶液中，获得羊肚菌原生质体溶液。在培养基平板上放无菌玻璃纸，介入尖顶羊肚菌培养，收集菌丝体，加入KCl、磷酸缓冲液和巯基乙醇进行洗涤，然后用蜗牛酶、溶壁酶和纤维素酶进行酶解，获得原生质体产量达到2.5×10⁴个/mg(″羊肚菌原生质体诱变筛选高生物量高氨基酸含量菌株″，刘士旺，梁宗琦，菌物系统，2，168-171，1999)。M培养基加入椰乳培养尖顶羊肚菌的菌丝体，加入硫酸镁和吗啡啉乙烷磺酸的混合液，然后加入不同组合的酶，产量最高为6.2×10⁶个原生质体/100mg.ml(″尖顶羊肚菌原生质体的分离及再生″，张览铭郑玉萍，云南植物研究，4，449-452，1989)。

采用目前现有方法制备原生质体，用菌丝直接进行酶解，酶解过程不能很好的控制，高渗透环境也会对原生质体造成一定的破坏，所以很难将原生质体的量提高上去，再生率也很差。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种羊肚菌原生质体的制备方法，该方法通过酶解制备原生质体的过程中通过添加四氢吡啶和谷胱甘肽来控制酶活力和稳定原生质体，有效的提高了原生质体的制备效率。