[发明专利]一种羊肚菌原生质体的制备方法

权利要求书

1.一种羊肚菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

S1、制备菌丝体培养基；

S2、制备再生培养基；

S3、培养菌丝体；

将羊肚菌菌种接种于所述步骤S1获得的菌丝体培养基中，于20-28℃，转速150-180r/min下培养4-6d至产生大量菌丝体，离心弃去上清液，得到菌丝体；

S4、原生质体的制备：

将所述S3步骤所获得的菌丝体加入渗透压稳定剂，洗涤2-4次，加入复合酶液进行酶解，于30℃-37℃下酶解1-3h，酶解中不断搅拌混匀，充分释放原生质体；所述渗透压稳定剂是由CaCl₂、四氢吡啶、谷胱甘肽和磷酸缓冲液组成的混合液体；

S5、原生质体纯化：

将所述步骤S4获得的原生质体进行纯化；

S6、原生质体再生：

将经纯化的原生质体加入渗透压稳定剂制成原生质体悬浮液，采用夹层法培养于再生培养基上，于20℃-28℃条件下培养1-3天，形成再生菌落。

2.根据权利要求1所述的羊肚菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中菌丝体培养基为：马铃薯180-200g，葡萄糖12-15g，蔗糖12-15g，酵母粉3-5g，硫酸镁0.1-0.5g，磷酸氢二钾0.5-1.0g，乳酸钠1-10g，水补足至1000mL。

3.根据权利要求1所述的羊肚菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中再生培养基为：马铃薯180-200g，蔗糖12-15g，琼脂10-15g，碳酸钙0.1-0.5g，磷酸氢二钾0.5-1.0g，β-巯基乙醇0.3-1g，环已六醇0.01-0.05g，KCl0.1-0.3g，水补足至1000mL。

4.根据权利要求1所述的羊肚菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中渗透压稳定剂为终浓度是1.0-1.4g/LCaCl₂、0.6-0.8g/L四氢吡啶、1-3g/L谷胱甘肽和0.5-1mol/L磷酸缓冲液组成的混合液体，pH值为5.0-6.0，经灭菌放冷后使用。

5.根据权利要求4所述的羊肚菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述渗透压稳定剂为终浓度是1.2g/LCaCl₂、0.6g/L四氢吡啶、1g/L谷胱甘肽和1mol/L磷酸缓冲液组成的混合液体，pH值为5.4。

6.根据权利要求1所述的羊肚菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中复合酶液为终浓度是1.0-3.0％纤维素酶，0.2-0.8％离析酶R-10和0.1-0.6％蜗牛酶组成的混合液体，所述复合酶液为复合酶置于渗透压稳定剂中，搅拌溶解至无粉末后，经40-50℃水浴活动8-10min，以4-8℃、1000-4500r/min条件离心10-15min，吸取酶液上清部分，经微孔滤膜过滤除菌后使用。

7.根据权利要求6所述的羊肚菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述复合酶液为终浓度是2.0％纤维素酶，0.5％离析酶R-10和0.3％蜗牛酶组成的混合液体。

8.根据权利要求1所述的羊肚菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中菌丝体与复合酶液的添加量为：每500mg菌丝体加入0.2-2ml复合酶液。

9.根据权利要求1所述的羊肚菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中纯化方法为：将所述步骤S4的酶解液离心，沉淀用渗透压稳定剂重悬；500-1000r/min离心8-10mnin，转移上清，沉淀再用渗透压稳定剂5～6次，分离上清，弃去沉淀；合并获得的上清液在1000-2000r/min下离心5-10min即可获得纯化的原生质体。