[发明专利]一种调控青钱柳悬浮细胞多糖含量增加的方法

权利要求书

1.一种调控青钱柳悬浮细胞多糖含量增加的方法，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：野外生长的青钱柳叶片，在MS培养基上，附加激素NAA 1mg/L，IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，诱导愈伤组织，诱导30天，继代4-5次，继代周期20天，取继代后的嫩绿松散的愈伤组织，加入White液体培养基中，附加激素TDZ0.1-0.5mg/l+IAA0.3-1.0mg/l，进行青钱柳悬浮细胞培养，培养30天后，在培养基中加入1-3mg/l稀土，进行悬浮细胞和多糖含量的调控，取样后采用水提法提取青钱柳多糖含量，提取时间为7.5 h，料液比为1:20，pH为8.5，使用树脂吸附法对多糖进行纯化，D₃₀₁R树脂对青钱柳多糖吸附量大，氯化钠洗脱效果最好，使用苯酚-硫酸法对纯化后的多糖进行检测。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：所述无菌的青钱柳外植体叶片和芽按照下述方法得到：取野生青钱柳叶片和芽，洗衣粉浸泡3分钟，流水冲洗1-2小时，经酒精消毒处理30s，氯化汞消毒处理8分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分。

3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：培养条件温度25℃，湿度70%，光照2000-4000lx，光期14h。

4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：青钱柳悬浮细胞的培养选择的培养基为White培养基，附加激素TDZ和IAA。

5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：调控青钱柳多糖的的稀土优选为硝酸镧。

6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：在培养基中加入的稀土为过滤灭菌。

7.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：本发明采用水提法提取，精密度RSD%为3.12%，重现性RSD%值为1.83%，稳定性RSD%值为3.8%。

8.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：本发明采用D₃₀₁R树脂对多糖进行纯化，吸附液25℃，浓度5mg·mL^－1，pH为7.0，吸附流度为1.8mL·min^－1时吸附较强。

9.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：本发明采用氯化钠进行洗脱，最佳洗脱浓度0.5mol·L^－1，洗脱率达89.72%。

10.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：本发明采用苯酚-硫酸法对青钱柳多糖进行检测，以葡萄糖标准液绘制标准曲线，加入1.5mL5%的苯酚溶液，硫酸5mL，显色温度80℃，在水浴中加热30min，在波长488nm下测定青钱柳多糖的含量，此种方法快速、显色稳定、重现性好、适用于青钱柳多糖含量的测定。