[发明专利]类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法

说明书

本发明涉及生物医疗技术领域，公开了类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法，准备好试验动物及其组织后，提取CIA大鼠关节总RNA，检测总RNA纯度、浓度，对总RNA反转录，合成5对特异性引物，以CIA大鼠cDNA为模板，使用15μL体系PCR检测，在凝胶成像系统中，隔离板将紫外线隔开，切下含有大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF‑κB cDNA片段的凝胶，快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，将回收出来的DNA片段连接至T‑Vector，转化后蓝白斑筛选及测序。本发明建立CIA大鼠模型，利用分子生物学手段检测类风湿关节炎大鼠关节中核因子κB亚基p65、Toll样受体4、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1、白介素6、核因子κB亚基等关键炎症因子的表达，对于实现早期预防和治疗RA具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，特别涉及类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一类常见免疫系统炎性疾病，影响全世界约1％的人群。RA表现为持久滑膜炎、全身性炎症，持续不断地产生自身抗体。其发病的确切病因尚不清楚，但环境及遗传因素参与了RA的发病。目前国际公认RA的一线治疗策略，是抗风湿药物早期联合使用，改善病情，控制RA发作，降低致残率，但仍有约30％的患者不能缓解，不受控制的活动期RA可以引起关节损坏、致残、生活质量降低、心血管病和其它并发病，这些问题也会加重病人焦虑情绪并使得病人不得不忍受情绪的低潮以及经济方面带来的巨大负担。

发明内容

发明的目的在于提供类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法，本发明建立CIA大鼠模型，利用分子生物学手段检测类风湿关节炎大鼠关节中核因子κB亚基p65(RelA)、Toll样受体4(TLR4)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1)、白介素6(IL6)、核因子κB亚基(NF-κB)等关键炎症因子的表达，本发明对于实现早期预防和治疗RA具有重要的意义，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法，包括如下步骤：

S1：准备试验动物及其组织

选取24只42±2日龄健康状况良好、体重相近(170±10g)Wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为2个试验组：I组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；II组，CIA模型组(n＝12)：多点皮下注射牛II型胶原；

S2：总RNA的提取

依据RNAiso Plus实验操作说明提取CIA大鼠关节总RNA；

S3：总RNA浓度的测定

NanoDrop ND-2000检测总RNA纯度、浓度

S4：cDNA合成

按照SYBR PrimeScript^TM RT Reagent Kit试剂盒操作说明进行，对总RNA反转录；

S5：引物设计与合成

参照已登录大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF-κB cDNA序列，利用Primer Premier5.0软件结合NCBI Blast在线引物设计，合成5对特异性引物；

S6：凝胶电泳检测

以CIA大鼠cDNA为模板，使用15μL体系PCR检测；

S7：回收和纯化PCR产物

在凝胶成像系统中，隔离板将紫外线隔开，切下含有大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF-κB cDNA片段的凝胶，快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收；